建立植入前遗传学检测人胚胎来源的无动物源性干细胞系

发布时间：2021-07-05 17:03

　　【目的】在无动物源性的干细胞培养体系中建立植入前遗传学检测（PGT）胚胎来源的人胚胎干细胞系,为医学研究提供疾病模型。【方法】在我们的研究中,对无动物源性的人类包皮成纤维细胞饲养层（XF-HFF）与成分确定的培养基（CDM）构建的无动物源性培养体系进行了评估。在该培养体系中,利用染色体平衡易位患者PGT来源的废弃胚胎建立一个新的人胚干细胞（hESC）细胞系。【结果】新建立的人胚胎干细胞系在无动物源性培养系统中可长期培养传代（>45个代次）。核型分析显示,在传代45代次后,新建立的人胚胎干细胞仍保持一致的核型。XF-HFF/CDM中的hESC仍保持多能性。通过荧光免疫染色检测到SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81等多能标志物的表达;RT-PCR分析显示,在XF-HFF/CDM培养体系上生长的hESC中存在干细胞标记。小鼠体内实验也证实了hESC在体内维持其多能性。【结论】本研究建立了PGT来源的人胚胎干细胞系,为进一步建立携带遗传疾病基因的hESC系并为临床研究和治疗提供疾病模型打下了基础。 

【文章来源】：中山大学学报(医学版). 2019,40(04)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

XF/HFF-CDM培养体系中hESC的干细胞标志物表达Fig.2ExpressionofstemcellmarkersinhESCgrowninXF-HFF/CDMCDA：SSEA-3；B：SSEA-4；C：Tra-1-60；D：Tra-1-81.SSEA：stage-specificembryonicantigen；Tra：tumorrejectionantigen.Thescalebarrepresents50μm.

???7~10d的悬浮培养，观察到有类胚体的形成。收集类胚体，加Trizol处理后用于RT-PCR检测到分化相关基因REX-1、SOX-2、LIN28、NPM1和GDF3基因的表达（图3），证实新建立的hESC系在体外具有分化的能力。2.4形态学结果提示分化潜能将AF-hESC注入严重免疫缺陷（SCID）小鼠体内能形成畸胎瘤，包括了来源于外、中、内3个胚层的组织：皮脂腺、肌纤维和肠上皮等（图4）。这表明AF-hESC具有多向分化潜能。2.5染色体核型结果对建立的干细胞系进行核型鉴定为46，XY，图3hESC多能性因子的表达Fig.3ExpressionofstemcellmarkersA：ectoderm：sebaceousgland；B：endoderm：musclefiber；C：mesoderm：intestinalepithelium（×20）图4在XF-HFF/CDM培养体系中新建立的hESC系的体内分化实验Fig.4InvivoanalysisofthepluripotencyofhESCculturedinXF-HFF/CDMABCt（1；20）（p13.3；q13.1；图5）。分别对第15、20、25、30代次和解冻后第36代的hESC进行了5次核型鉴定，均为同一异常核型。3讨论hESC建系及培养过程中，外源性成分主要来源于这几个方面：①饲养层细胞或无饲养层基质的动物性成分，或者暴露于含动物蛋白的培养基中；②hESC培养基中添加的动物蛋白血清，如FBS和SR；③常用于去除滋养层细胞获得ICM的免疫外科法也会使胚胎接触动物蛋白。一直以来，研究者们就致力于优化hESC的培养体系，消除培养体系中的动物源性成分，以期获得完全无动物源性的hESC培养体系和hESC系。图5在XF-HFF/CDM培养体系中新建立的hESC系?

（POU5F1）（图3）。为进一步检测干细胞系的分化能力，我们将hESC在无饲养层的低粘附皿中用20%FBS-DMEM培养基经过7~10d的悬浮培养，观察到有类胚体的形成。收集类胚体，加Trizol处理后用于RT-PCR检测到分化相关基因REX-1、SOX-2、LIN28、NPM1和GDF3基因的表达（图3），证实新建立的hESC系在体外具有分化的能力。2.4形态学结果提示分化潜能将AF-hESC注入严重免疫缺陷（SCID）小鼠体内能形成畸胎瘤，包括了来源于外、中、内3个胚层的组织：皮脂腺、肌纤维和肠上皮等（图4）。这表明AF-hESC具有多向分化潜能。2.5染色体核型结果对建立的干细胞系进行核型鉴定为46，XY，图3hESC多能性因子的表达Fig.3ExpressionofstemcellmarkersA：ectoderm：sebaceousgland；B：endoderm：musclefiber；C：mesoderm：intestinalepithelium（×20）图4在XF-HFF/CDM培养体系中新建立的hESC系的体内分化实验Fig.4InvivoanalysisofthepluripotencyofhESCculturedinXF-HFF/CDMABCt（1；20）（p13.3；q13.1；图5）。分别对第15、20、25、30代次和解冻后第36代的hESC进行了5次核型鉴定，均为同一异常核型。3讨论hESC建系及培养过程中，外源性成分主要来源于这几个方面：①饲养层细胞或无饲养层基质的动物性成分，或者暴露于含动物蛋白的培养基中；②hESC培养基中添加的动物蛋白血清，如FBS和SR；③常用于去除滋养层细胞获得ICM的免疫外科法也会使胚胎接触动物蛋白。一直以来，研究者们就致力于优化hESC的培养体系，消除培养体系中的动物?

【参考文献】：
期刊论文
[1]无动物源性成分人胚胎干细胞培养体系与其它人胚胎干细胞培养体系的比较[J]. 张丹,麦庆云,李涛,徐艳文,丁晨辉,宏苹苹,曾艳红,周灿权.  中山大学学报(医学科学版). 2012(06)



本文编号：3266469