钙离子及水解酶在HIV-1 Vpu对宿主限制因子Tetherin拮抗过程中的作用研究

发布时间：2017-04-26 00:13

  本文关键词：钙离子及水解酶在HIV-1 Vpu对宿主限制因子Tetherin拮抗过程中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Tetherin（BST2，，CD317）是一类天然宿主限制因子，可由干扰素α诱导表达。Tetherin具有广谱的抗病毒功能，能够抑制多种包膜病毒从宿主细胞中释放，而此功能依赖于其特定的拓扑和空间结构。Tetherin是一种II型膜蛋白，其整体结构由N端胞浆区（CT）、单次穿膜螺旋区（TM）、胞外螺旋区，C端糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI）锚定区构成。为了拮抗Tetherin对病毒释放的束缚作用， HIV-1通过编码Vpu蛋白帮助新生病毒粒子顺利脱逃。Vpu是HIV-1特有的I型膜蛋白，包含一段较短的胞外区，一段由α单股螺旋穿膜区，一段双股α螺旋胞内区。HIV-1Vpu对宿主限制因子Tetherin的拮抗作用对于HIV-1新生病毒粒子的顺利出芽和释放十分重要，但其通过何种机制拮抗Tetherin的作用尚不明确。这几年国际上对此问题的报道是逐步深化的，开始主要集中在Vpu对Tetherin的降解作用，随后进展为对Tetherin细胞表面定位的下调作用，但进一步的研究表明这二者都不是最主要的作用，Vpu对Tetherin的拮抗机制仍有待进一步阐明。 Vpu的同源寡聚体能够形成弱选择性钾离子通道，同时也有报道其可能干扰细胞的背景钾离子通道TASK的功能，但这类通道活性是否在促进释放和拮抗Tetherin方面具有作用仍不明确。Vpu具有离子通道活性，暗示其对细胞的膜电位以及胞内外的某些重要离子（如钙离子）的平衡可能有潜在影响。而Tetherin的物理系留作用使得我们和其他研究者们猜想Vpu可能通过激活某种形式的水解酶的活力来对Tetherin进行切割从而促进病毒释放。本论文在以上三个方面做了初步的探索性研究，为该研究领域提供了新思路。 本论文首先探究了Vpu的存在是否影响细胞内钙离子的浓度以及这种变化是否与Vpu自身的离子通道活性相关。我们在瞬时转染或稳定转染Vpu的细胞中利用钙荧光探针Fluo-4AM标记细胞内的钙离子，通过流式细胞术和倒置荧光显微镜镜检两种手段均检测到Vpu对细胞内钙离子浓度具有上调作用。 其次，本论文研究了细胞内钙浓度的变化是否会影响Vpu对Tetherin的拮抗作用，以及这一过程中是否有电压依赖钙离子通道的参与。荧光定量PCR结果显示，293T细胞和Hela细胞均能够内源性表达L型钙离子通道和T型钙离子通道相关亚基。利用RNA干扰和使用拮抗剂阻断钙通道等方法检测了VDCC对病毒释放的影响，结果表明，Vpu对Tetherin的拮抗作用可能与T型VDCC相关。此外，通过流式细胞术发现VDCC并不参与Vpu对细胞表面Tetherin表达量的下调过程。这些实验结果暗示Vpu可能通过T型VDCC调控细胞内钙离子浓度，而钙离子可能通过某些需要进一步研究的其他机制，如阻止Tetherin定位于病毒出芽位点或者激活某些水解酶类的方式，来拮抗Tetherin的功能。 此外，本论文探讨了一些可能作用于Tetherin的水解酶是否参与Vpu拮抗Tetherin过程。通过添加不同水解酶抑制剂的方法检测各类水解酶对HIV-1病毒释放的影响，证实了Vpu对Tetherin的拮抗作用与磷脂酶C、磷脂酶D和MMP不具有直接相关性，但MMP可能促进HIV-1病毒释放。我们还发现Tetherin存在潜在的弗林蛋白酶作用位点，但通过对该位点进行点突变，观察到Tetherin突变体的蛋白条带没有发生迁移现象，我们基本排除了弗林蛋白酶作用于Tetherin的可能性。 通过以上实验，我们对这些可能参与Vpu拮抗Tetherin过程的调控分子进行了尝试性摸索。这些实验结果帮助我们对Vpu与Tetherin的相互作用机制有了更深入的了解，为我们今后的探索方向提供一定的借鉴。在未来我们将设计更精细的实验深入研究Vpu引起的胞浆钙浓度的提升是否能够调控Vpu对Tetherin的拮抗过程，以及T型VDCC在这个过程中所发挥的作用。此外，初步探究Vpu对Tetherin的拮抗作用是否与膜曲率变化相关。通过这些探索性实验，尝试发现钙离子与Vpu/Tetherin作用途径的潜在关联并揭示一条新的依赖钙离子的Vpu对Tetherin的拮抗途径。
【关键词】：HIV-1 Tetherin Vpu 拮抗作用 钙离子 VDCC 水解酶 膜曲率
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 前言13-29
• 1.1 宿主限制因子 Tetherin 的研究现状13-16
• 1.1.1 Tetherin 的结构13-14
• 1.1.2 Tetherin 的抗病毒机制14-16
• 1.2 HIV-1 Vpu 的研究现状16-19
• 1.2.1 HIV-1 简介16-17
• 1.2.2 Vpu 的结构与离子通道活性17-18
• 1.2.3 Vpu 对 Tetherin 拮抗作用18-19
• 1.3 HIV-1 病毒释放过程相关调控因素的研究现状19-23
• 1.3.1 钙离子对 HIV-1 病毒释放的调控作用19-20
• 1.3.2 细胞膜去极化与 HIV-1 病毒释放20-23
• 1.3.2.1 Vpu 引起的细胞膜去极化与其促病毒释放的关系20-21
• 1.3.2.2 电压依赖钙离子通道简介21-23
• 1.3.2.3 电压依赖钙离子通道在免疫细胞中的表达23
• 1.4 几类可能作用于 Tetherin 的水解酶简介23-26
• 1.4.1 磷脂酶23-25
• 1.4.1.1 磷脂酶简介23
• 1.4.1.2 GPI 锚定蛋白与磷脂酶23-24
• 1.4.1.3 磷脂酶作用于 Tetherin 的可行性的相关研究现状24-25
• 1.4.2 基质金属蛋白酶25
• 1.4.2.1 基质金属蛋白酶简介25
• 1.4.2.2 Tetherin 与基质金属蛋白酶的相互作用25
• 1.4.3 弗林蛋白酶（Furin）25-26
• 1.5 论文设计与实验方案26-29
• 1.5.1 论文目的26-27
• 1.5.2 实验设计27-29
• 1.5.2.1 Vpu 的离子通道活性对细胞内钙浓度的影响27
• 1.5.2.2 细胞内钙浓度对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响27-28
• 1.5.2.3 水解酶对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响28-29
• 第二章 实验材料和方法29-40
• 2.1 材料与试剂29-31
• 2.2 主要仪器31-32
• 2.3 实验方法32-40
• 2.3.1 质粒构建32-34
• 2.3.2 细胞培养及转染34
• 2.3.3 蛋白电泳与免疫印迹34-35
• 2.3.4 稳定表达细胞系的构建35
• 2.3.5 细胞周期同步化35-36
• 2.3.6 细胞内游离钙离子浓度测定36
• 2.3.7 流式细胞术36-37
• 2.3.8 病毒的收集及含量测定37
• 2.3.9 RNA 干扰及效果评价37-40
• 2.3.9.1 siRNA 的合成与转染37-38
• 2.3.9.2 细胞总 RNA 的提取38
• 2.3.9.3 RNA 逆转录为 cDNA38
• 2.3.9.4 荧光定量 PCR38-40
• 第三章 实验结果40-65
• 3.1 Vpu 的离子通道活性对细胞内钙浓度的影响40-47
• 3.1.1 Vpu 及 Vpu 突变体的 RFP 融合表达载体的构建40-42
• 3.1.2 验证 Vpu 对细胞内钙浓度的影响42-45
• 3.1.3 验证 Vpu 对细胞钙浓度的上调与 Vpu 自身离子通道的相关性45-46
• 3.1.4 在稳定表达 Vpu 的 293T 细胞系中验证 Vpu 对细胞钙浓度的上调现象46-47
• 3.2 细胞内钙浓度对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响47-59
• 3.2.1 广谱型钙通道拮抗剂 CdCl2对病毒释放的影响48-50
• 3.2.2 T 型 VDCC 对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响50-54
• 3.2.2.1 T 型 VDCC 的亚基α1G，α1H 在 293T、Hela 细胞中的内源表达检测50-51
• 3.2.2.2 T 型 VDCC 拮抗剂 Ethosuximide 对病毒释放的影响51
• 3.2.2.3 沉默 T 型 VDCC 表达后检测病毒释放变化51-53
• 3.2.2.4 T 型 VDCC 拮抗剂 Ethosuximide 对细胞表面 Tetherin 表达量的影响53-54
• 3.2.3 L 型 VDCC 对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响54-59
• 3.2.3.1 L 型 VDCC 的亚基α1C，α1D 在 293T、Hela 细胞中的内源表达检测54-55
• 3.2.3.2 L 型 VDCC 拮抗剂 Nifedipine 对病毒释放的影响55-56
• 3.2.3.3 沉默 L 型 VDCC 表达后检测病毒释放变化56-58
• 3.2.3.4 L 型 VDCC 拮抗剂 Nifedipine 对细胞表面 Tetherin 表达量的影响58-59
• 3.3 水解酶对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响59-65
• 3.3.1 磷脂酶 C 对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响59-61
• 3.3.2 磷脂酶 D 对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响61-62
• 3.3.3 MMP 对 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影响62-63
• 3.3.4 验证 Tetherin 的潜在弗林蛋白酶切割位点的可行性63-65
• 第四章 讨论65-68
• 结论68-69
• 参考文献69-75
• 作者简介75
• 在学期间主要科研成果75-76
• 致谢76

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