重组HER2胞外段的表达及其卵黄抗体的制备

发布时间：2017-04-26 02:10

  本文关键词：重组HER2胞外段的表达及其卵黄抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor2，HER2）的表达水平与一些肿瘤的发生发展相关,其中约25%的乳腺癌患者HER2表达水平明显升高，因此，研制靶向HER2的抗体等制剂可以用于乳腺癌等肿瘤的诊断。 卵黄抗体是从禽蛋中提取出来的IgY，相当于哺乳动物的与IgG。与IgG相比，IgY具有如下优点：1）不与哺乳动物Fc受体结合；2）不与G蛋白、A蛋白及类风湿因子结合；3）不激活补体。当用作诊断试剂时，IgY可以有效降低反应体系中的背景值及假阳性，显示出独有的应用空间。 本课题的目的是利用基因工程重组人HER2胞外段蛋白（rHER2-ECD），通过免疫蛋鸡分别制备rHER2-ECD特异性血清抗体和卵黄抗体，为卵黄抗体的制备搭建实验平台。首先，我们将编码HER2-ECD的基因克隆入pET-28a质粒载体，并用IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达rHER2-ECD，经SDS-PAGE电泳及Tanon软件分析HER2-ECD的表达量不足10%，且以包涵体形式表达。然后，我们选择昆虫表达系统，通过克隆-亚克隆方法构建了含有重组HER2-ECD基因的杆状病毒，，为后续在昆虫细胞中表达rHER2-ECD奠定了基础。为了尝试制备卵黄抗体，我们利用镍亲和层析法从大肠杆菌中将诱导表达的rHER2-ECD纯化出来，经初步电泳及Western blot鉴定后，用rHER2-ECD免疫蛋鸡，收取蛋鸡的血清和鸡蛋，从蛋黄中提取卵黄抗体，以间接ELISA进行检测。结果显示：卵黄抗体持续时间比血清抗体长；卵黄抗体能在体外识别高表达HER2的肿瘤细胞。我们的结果提示，真核基因在大肠杆菌中表达水平低可能与密码子偏爱性有关，卵黄抗体的制备可以成为廉价、高水平制备检测抗体的有效技术平台。
【关键词】：人表皮生长因子受体-2 细胞外段 卵黄抗体 大肠杆菌 杆状病毒
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;R737.9
【目录】：

• 提要4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 第1章 前言15-33
• 1.1 人表皮生长因子受体-2（HER2）简介15-23
• 1.1.1 HER2 的生理功能及作用机制15-17
• 1.1.2 HER2 与肿瘤17-19
• 1.1.3 靶向 HER2 的肿瘤治疗研究19-23
• 1.2 卵黄抗体简介23-29
• 1.2.1 卵黄抗体的特点23-24
• 1.2.2 卵黄抗体的应用优势24-27
• 1.2.3 卵黄抗体的应用现状27-29
• 1.2.4 IgY 在应用上的局限性29
• 1.3 杆状病毒表达系统（BVES）简介29-33
• 1.3.1 BVES 及其原理简介29-31
• 1.3.2 BVES 的优点31-33
• 第2章 材料与方法33-51
• 2.1 实验材料与仪器33-35
• 2.1.1 实验试剂33
• 2.1.2 引物合成及测序由上海生物工程有限公司完成33
• 2.1.3 菌种及质粒33
• 2.1.4 培养基配制33-34
• 2.1.5 细胞株和实验动物：34
• 2.1.6 主要实验设备34-35
• 2.2 实验方法35-51
• 2.2.1 HER2-ECD 在大肠杆菌中的构建、表达及鉴定35-43
• 2.2.2 rHER2-ECD 特异性卵黄抗体的制备43-46
• 2.2.3 HER2-ECD 在杆状病毒表达系统（BVES）中的表达46-51
• 第3章 实验结果51-71
• 3.1 rHER2-ECD 在大肠杆菌中的构建、表达及鉴定51-58
• 3.1.1 HER2-ECD 基因的获取、T-A 克隆的构建及其鉴定51-52
• 3.1.2 HER2-ECD 基因亚克隆至 PET-28a 表达载体及其鉴定52-53
• 3.1.3 rHER2-ECD 的诱导表达及鉴定53-58
• 3.2 抗 rHER2-ECD 卵黄抗体的制备58-63
• 3.2.1 rHER2-ECD 免疫蛋鸡58-59
• 3.2.2 间接 ELISA 方法检测鸡 H/鸡 B 血清及卵黄中特异性抗体的产生59-60
• 3.2.3 卵黄抗体滴度检测60-61
• 3.2.4 Western Blot 检测 IgY-HER2 是否可识别肿瘤细胞中的HER261-63
• 3.3 HER2-ECD 在杆状病毒表达系统中的表达63-71
• 3.3.1 HER2-ECD 基因的获取及 T-A 克隆的构建63-64
• 3.3.2 HER2-ECD 基因亚克隆至转移载体 pFastBacTM1 中及其鉴定64-65
• 3.3.3 pFastBacTM1-HER2-ECD 转化 DH10Bac 及重组子的筛选65-66
• 3.3.4 重组 Bacmid-HER2-ECD 质粒转染 Sf-9 昆虫细胞66-69
• 3.3.5 SDS-PAGE 分析 rHER2-ECD 的表达情况69-71
• 第4章 讨论71-79
• 4.1 rHER2-ECD 在大肠杆菌表达量低的原因的探讨71-72
• 4.2 纯化的 rHER22-ECD 混有杂蛋白的原因分析72-73
• 4.3 蛋白免疫蛋鸡后产生的卵黄抗体滴度不高的原因分析73-74
• 4.4 Western blot 检测 rHER2-ECD 特异性卵黄抗体对高表达HER2 的乳腺癌细胞的识别作用时，结果呈多条带显色的原因分析74-75
• 4.5 卵黄和血清中的特异性 IgY 的比较75-76
• 4.6 rHER2-ECD 在杆状病毒表达系统中表达失败的原因分析76-79
• 结论79-81
• 参考文献81-89
• 攻读学位期间取得的科研成果89-91
• 致谢91-93

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 刘孝荣;贺智敏;杨芳;余艳辉;吕辉;周敏;陈主初;;人HER2胞外区基因重组及重组蛋白的纯化[J];生物医学工程学杂志;2006年01期

2 许银辉;郭晓芳;邬仙华;钱晨旭;罗磊;徐莲花;冯紫雅;张小影;;HER2胞外段的克隆与原核表达[J];生物技术通报;2012年08期

  本文关键词：重组HER2胞外段的表达及其卵黄抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：327533