A型流感病毒四种亚型同步检测分型方法建立及两株H5N1亚型禽流感病毒地方株的特性研究

发布时间：2021-07-16 15:39

　　对人类危害巨大的季节性流感主要由H1N1和H3N2亚型流感病毒引起,两种亚型病毒常合并在一起感染流行；另一方面,近年来在不同地区爆发禽流感主要由H5N1和H9N2亚型感染引起,并正在跨越种族界限,从禽类直接感染人,引起极高的死亡率。由于各种亚型流感病毒所致疾病的治疗和防控策略不同,建立可以同时进行H1、H3、H5、H9四种亚型病毒检测和分型的快速检测方法,对于流感的早期诊断和制定有效防治策略有重要意义。本论文围绕H1、H3、H5、H9四种亚型流感病毒同步快速检测和分型方法的建立,以及两株H5N1亚型禽流感病毒地方分离株的生物学特性开展研究,取得了以下成果：1.采用SPF鸡胚扩增了H1N1、H3N2、H5N1和H9N2四种亚型流感病毒,测定了四种亚型流感病毒的EIDso和血凝效价,计算了病毒的滴度。2.从NCBI数据库中下载了H1、H3、H5、H9以及M基因的序列,用CLUSTALX软件比对分析,找出各亚型的保守序列,优化设计了适合四种亚型病毒HA基因和A型流感病毒M基因同步扩增的多重RT-PCR检测引物。通过摸索与优化实验条件,建立了A型流感病毒H1、H3、H5、H9亚型同步检测分型的... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：84 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 流感病毒病原生物学与流感防治技术综述
    1.1 流感病毒一般特性
    1.2 A型流感病毒的基因组结构以及编码蛋白
    1.3 A型流感病毒的感染和复制
    1.4 流感流行病学
    1.5 流感病毒的抗原变异
    1.6 流感疫苗
        1.6.1 灭活疫苗
        1.6.2 减毒活疫苗
        1.6.3 亚单位基因工程疫苗
        1.6.4 DNA疫苗
        1.6.5 基因重组活载体疫苗
    1.7 抗流感药物
        1.7.1 作用于神经氨酸酶药物
        1.7.2 作用于M2离子通道蛋白的药物
        1.7.3 作用于病毒其它蛋白的药物
        1.7.4 作用于宿主的药物
    1.8 流感检测技术
        1.8.1 病原学检测
        1.8.2 血清学检测
        1.8.3 分子生物学检测
    1.9 流感的多重RT-PCR检测技术国内外研究进展
    1.10 本论文的目的和意义
第二章 A型流感病毒H1、H3、H5、H9亚型病毒核酸同步快速检测和分型的多重RT-PCR方法建立
    2.1 材料
        2.1.1 A型流感病毒毒株与鸡胚
        2.1.2 主要仪器设备和分子生物学软件
        2.1.3 主要试剂与耗材
    2.2 方法
        2.2.1 流感病毒鸡胚扩增
        2.2.2 病毒血凝效价测定
        2.2.3 病毒EID_(50)(50% Egg Infection Dose)测定
        2.2.4 引物设计与优化
        2.2.5 病毒RNA的提取及反转录
        2.2.6 cDNA片段的单模板RT-PCR扩增
        2.2.7 cDNA片段的多模板RT-PCR扩增
        2.2.8 标准品质粒的构建
        2.2.9 PCR检测病毒RNA的灵敏度
    2.3 实验结果
        2.3.1 克隆质粒分子量,浓度及最终拷贝数的换算结果
        2.3.2 各亚型HA效价结果
        2.3.3 各亚型EID50结果
        2.3.4 引物设计和PCR反应条件
        2.3.5 单模板的四重引物特异性分析
        2.3.6 多模板的四重引物特异性分析
        2.3.7 单模板的五重引物特异性分析
        2.3.8 多模板的五重引物特异性分析
        2.3.9 单模板的五重引物特异性分析(加入H7)
        2.3.10 多模板的五重引物特异性分析(加入H7)
        2.3.11 H1、H3、H5、H9亚型流感病毒多重RT-PCR灵敏度
        2.3.12 样品检测
    2.4 讨论
第三章 H5N1禽流感病毒地方株的分离和特性研究
    3.1 材料
        3.1.1 主要试剂与耗材
        3.1.2 主要仪器设备和分子生物学软件
    3.2 方法
        3.2.1 样品采集过程
        3.2.2 细胞培养过程中用到的玻璃器皿的处理方法
        3.2.3 细胞培养室和超净工作台的消毒
        3.2.4 细胞培养与病毒的克隆与纯化
        3.2.5 细胞的冻存与复苏
        3.2.6 序列的生物信息学分析
        3.2.7 2株病毒人工感染Balb/c小鼠的致病性特性研究
        3.2.8 病毒在小鼠肺组织中滴度测定
    3.3 结果
        3.3.1 2株禽流感病毒H5N1地方株的分离鉴定
        3.3.2 2株禽流感病毒H5N1地方株的HA和NA的核苷酸测序结果
        3.3.3 2株禽流感病毒H5N1地方株的BLAST比对分析的结果
        3.3.4 2株禽流感病毒H5N1地方株的HA基因系统进化树分析的结果
        3.3.5 2株禽流感病毒H5N1地方株的NA基因系统进化树分析结果
        3.3.6 2株禽流感病毒H5N1地方株HA蛋白氨基酸同源性
        3.3.7 2株禽流感病毒H5N1地方株NA蛋白氨基酸同源性
        3.3.8 2株禽流感病毒感染小鼠的致病性结果
    3.4 讨论
研究总结
参考文献
博士在读期间发表的论文
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]禽流感疫苗研究进展[J]. 李迎晓,焦凤超,易本驰,赵瑜.  上海畜牧兽医通讯. 2012(05)
[2]H5亚型鸭源流感病毒HA基因序列生物信息学分析[J]. 李雪雁,罗挚新,叶海林,梁德胡,廖蔚蓝.  中国兽医学报. 2012(10)
[3]猪流感疫苗研究进展[J]. 崔克,江甜.  兽医导刊. 2012(02)
[4]禽流感病毒RT-PCR ELISA诊断方法的建立[J]. 杨少华,胡北侠,许传田,颜士敢,张琳,黄艳艳,张秀美.  中国农学通报. 2012(02)
[5]禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 李娜,张保平,秦爱建.  安徽农业科学. 2011(28)
[6]甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立[J]. 王云龙,周春峰,孙新城,李玉林,陈冬焕,李恒思,昌静峰,王国强,董彩文,刘旺根.  动物医学进展. 2011(08)
[7]双重RT-PCR同时快速检测H5亚型禽流感病毒和新城疫病毒强毒株[J]. 张斌,汤承,张兆敏,马莉,刘小银,李明义,岳华.  中国动物检疫. 2009(02)
[8]区分禽流感病毒亚型诊断基因芯片的构建[J]. 杨忠苹,王秀荣,石霖,田丽娜,王煜,陶启蒙,陈化兰.  中国动物检疫. 2008(10)
[9]H5N1亚型禽流感病毒核蛋白NP的原核表达及抗体制备[J]. 罗孟成,陶攀,肖庚富,潘兹书.  中国人兽共患病学报. 2008(03)
[10]H5亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立[J]. 包红梅,王秀荣,刘丽玲,王昱,李一经,陈化兰.  中国生物工程杂志. 2007(05)

硕士论文
[1]流感裂解灭活疫苗纯化工艺的开发[D]. 杜丽娟.大连理工大学 2006



本文编号：3287286