钙稳态系统在白念珠菌形态发生及压力应答中的功能研究

发布时间：2021-07-17 15:31

　　白念珠菌是临床常见的条件性致病真菌之一。由于重症特护人群、免疫缺陷人群的增加及抗生素的滥用,白念珠菌感染,尤其是白念珠菌侵袭性感染备受人们关注。白念珠菌是一种典型的两型性真菌,具有菌丝发育、生物被膜形成等形态发生能力,这些能力与该真菌的形态发生调控网络及分泌途径具有密切联系。不仅如此,白念珠菌还具有极为精细的环境压力应答系统,用以感应抗真菌药物、氧化胁迫、营养匮乏等诸多环境压力,并对其作用应答,使自身得以存活与生长。白念珠菌的形态发生与压力应答能力均是白念珠菌在宿主体内进行有效定殖并造成感染所必需的,而这些能力又与白念珠菌钙稳态系统的功能紧密相关。内质网与液泡是白念珠菌细胞两种极为重要的细胞器。前者是细胞分泌途径的核心,同时也是介导压力应答的主要细胞器。后者是白念珠菌细胞最主要的钙库,在调控细胞钙稳态方面扮演着重要角色。尽管白念珠菌钙稳态系统中的许多成员已为人们所知,但维持内质网功能所必需的钙泵尚未得到鉴定,且液泡钙通道Yvc1的功能仍属未知。此外,尽管人们已明确白念珠菌钙通道在形态发生及压力应答过程中发挥重要功能,但目前尚无有效抑制钙通道活性,进而指导临床实践的报道。本研究针对以上三... 

【文章来源】：南开大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：234 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    第一节 白念珠菌的生物学特性与流行病学
        1.1.1 白念珠菌的生物学特性
        1.1.2 白念珠菌的流行病学
    第二节 白念珠菌的形态发生
        1.2.1 白念珠菌形态发生概述
        1.2.2 白念珠菌两型性转换及其调节机制
    第三节 酿酒酵母及白念珠菌的压力应答机制
        1.3.1 CCS途径
        1.3.2 ERAD途径
        1.3.3 UPR途径
        1.3.4 SSR途径
        1.3.5 CWI型MAPK途径
        1.3.6 Hog1途径
    第四节 白念珠菌的钙信号系统
        1.4.1 白念珠菌的钙稳态系统
        1.4.2 白念珠菌的钙信号途径
    第五节 选题依据与技术路线
        1.5.1 选题依据与研究意义
        1.5.2 技术路线
第二章 内质网钙泵Spf1在白念珠菌形态发生及压力应答过程中的功能
    第一节 实验材料
        2.1.1 菌株、质粒与引物
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 培养基
    第二节 实验方法
        2.2.1 白念珠菌的转化
        2.2.2 大肠杆菌的CaCl_2法转化
        2.2.3 大肠杆菌质粒的提取
        2.2.4 白念珠菌及酿酒酵母基因组的提取
        2.2.5 白念珠菌Spf1蛋白C端的标记
        2.2.6 白念珠菌SPF1基因的敲除
        2.2.7 Southern blotting
        2.2.8 白念珠菌总蛋白的提取
        2.2.9 Spf1蛋白的提取、纯化与检测
        2.2.10 ATPase活性分析
        2.2.11 Western blotting
        2.2.12 白念珠菌生长曲线的测定
        2.2.13 白念珠菌菌丝诱导
        2.2.14 白念珠菌絮凝能力测定
        2.2.15 白念珠菌粘附能力测定
        2.2.16 白念珠菌生物被膜形成能力测定
        2.2.17 白念珠菌敏感性测定
        2.2.18 白念珠菌毒力分析
    第三节 结果与分析
        2.3.1 白念珠菌钙泵Spf1的鉴定
        2.3.2 Spf1蛋白的纯化及酶学特性
        2.3.3 白念珠菌SPF1基因敲除菌株及其回补株的构建
        2.3.4 SPF1基因缺失对白念珠菌正常生长速率的影响
        2.3.5 SPF1基因缺失对白念珠菌形态发生能力的影响
        2.3.6 SPF1基因缺失对白念珠菌压力应答能力的影响
        2.3.7 SPF1基因缺失对白念珠菌毒力的影响
    第四节 讨论
        2.4.1 内质网钙泵Spf1蛋白的鉴定
        2.4.2 Spf1在白念珠菌正常生长过程中的功能
        2.4.3 Spf1在白念珠菌形态发生中的功能
        2.4.4 Spf1在白念珠菌压力应答中的功能
        2.4.5 Spf1在白念珠菌致病过程中的作用
    第五节 小结
第三章 内质网钙泵Spf1在白念珠菌形态发生及压力应答过程中的作用机制
    第一节 实验材料
        3.1.1 菌株、质粒与引物
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 培养基
    第二节 实验方法
        3.2.1 大肠杆菌的电转化
        3.2.2 酿酒酵母的转化
        3.2.3 白念珠菌Cdcl01的血凝素(HA)标记
        3.2.4 白念珠菌内质网功能基因SEC61启动子报告质粒的构建
        3.2.5 白念珠菌胞质钙及总钙含量的测定
        3.2.6 分泌型酸性磷酸酶(SAP)分析
        3.2.7 内切糖苷酶(EndoH)分析
        3.2.8 白念珠菌细胞壁组成分析
        3.2.9 白念珠菌细胞壁压力敏感性测定
        3.2.10 白念珠菌原生质体制备及再生
        3.2.11 β-半乳糖苷酶活性分析
        3.2.12 白念珠菌RNA提取、基因组DNA消化及RNA反转录
        3.2.13 实时定量PCR(RT-PCR)
        3.2.14 其他方法
    第三节 结果与分析
        3.3.1 SPF1基因缺失对白念珠菌钙稳态的影响
        3.3.2 SPF1基因缺失对白念珠菌内质网功能的影响
        3.3.3 SPF1基因缺失对白念珠菌细胞壁组成与功能的影响
        3.3.4 SPF1基因缺失对白念珠菌基因表达的影响
    第四节 讨论
        3.4.1 Spf1在白念珠菌细胞钙稳态维持中的作用
        3.4.2 Spf1在白念珠菌内质网功能维持中的作用
        3.4.3 Spf1在白念珠菌CWI维持中的作用
        3.4.4 SPF1基因缺失对白念珠菌基因表达的影响
    第五节 小结
第四章 液泡钙通道Yvc1在白念珠菌形态发生及压力应答中的作用
    第一节 实验材料
        4.1.1 菌株、质粒与引物
        4.1.2 主要仪器
        4.1.3 主要试剂
    第二节 实验方法
        4.2.1 YVC1回补质粒pDDB78-YVC1的构建
        4.2.2 YVC1回补菌株及URA3原位回补菌株的构建
        4.2.3 白念珠菌生长曲线的测定
        4.2.4 胞质钙浓度检测
        4.2.5 菌丝诱导
        4.2.6 侵染式生长能力测定
        4.2.7 絮凝能力测定
        4.2.8 生物被膜形成能力测定
        4.2.9 白念珠菌氧化压力敏感性及相关生理生化指标的测定
        4.2.10 RT-PCR
        4.2.11 液泡、顶体及胞质钙的荧光显微观察
        4.2.12 小鼠系统性感染模型
        4.2.13 上皮细胞侵染模型
    第三节 结果与分析
        4.3.1 YVC1回补菌株及URA3原位回补菌株的构建
        4.3.2 YVC1缺失对白念珠菌压力敏感性的影响
        4.3.3 YVC1缺失对白念珠菌压力刺激下钙波动的影响
        4.3.4 YVC1缺失对白念珠菌形态发生能力的影响
        4.3.5 YVC1缺失对白念珠菌液泡、顶体及胞质钙分布的影响
        4.3.6 YVC1缺失对白念珠菌毒力的影响
    第四节 讨论
        4.4.1 Yvc1在白念珠菌压力应答中的作用
        4.4.2 Yvc1在白念珠菌形态发生中的作用
        4.4.3 Yvc1在白念珠菌致病过程中的作用
        4.4.4 钙信号系统介导白念珠菌形态发生及压力应答的相关机制
    第五节 小结
第五章 钙通道阻断剂对白念珠菌形态发生及压力应答的影响
    第一节 实验材料
        5.1.1 菌株及引物
        5.1.2 主要仪器
        5.1.3 主要试剂
        5.1.4 培养基
    第二节 实验方法
        5.2.1 碱性pH刺激下白念珠菌胞质钙浓度的测定
        5.2.2 药物压力下白念珠菌胞质钙及总钙含量的测定
        5.2.3 β-半乳糖苷酶分析
        5.2.4 钙通道阻断剂对白念珠菌生长抑制效果的测定
        5.2.5 钙通道阻断剂与抗真菌药物联用对白念珠菌生长抑制效果的测定
        5.2.6 verapamil对白念珠菌菌丝发育抑制效果的测定
        5.2.7 verapamil对白念珠菌生物被膜抑制效果的测定
        5.2.8 verapamil与抗真菌药物联用对生物被膜形成抑制效果测定
        5.2.9 verapamil与抗真菌药物联用对生物被膜维持抑制效果测定
        5.2.10 RT-PCR
    第三节 结果与分析
        5.3.1 钙通道阻断剂对碱性刺激下胞质钙波动的影响
        5.3.2 钙通道阻断剂对药物压力下胞质钙及总钙含量的影响
        5.3.3 钙通道阻断剂对白念珠菌正常生长的影响
        5.3.4 钙通道阻断剂对白念珠菌药物耐受性的影响
        5.3.5 verapamil对白念珠菌菌丝发育的影响
        5.3.6 verapamil对白念珠菌生物被膜发育的影响
        5.3.7 verapamil对白念珠菌形态发生相关基因表达的影响
    第四节 讨论
        5.4.1 钙通道阻断剂对白念珠菌钙内流的抑制作用
        5.4.2 钙通道阻断剂对白念珠菌药物压力应答的影响
        5.4.3 钙通道阻断剂对白念珠菌形态发生的影响
    第五节 小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 主要创新点
    6.3 相关工作的前景展望
参考文献
致谢
附录
个人简历及在学期间发表的学术论文



本文编号：3288444