鹦鹉热嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的预测、鉴定及特性的研究

发布时间：2017-04-27 00:05

  本文关键词：鹦鹉热嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的预测、鉴定及特性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：预测、筛选鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci, Cps）III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)效应蛋白，研究其细胞内定位和特征。 方法：计算机辅助的生物信息学方法Effective T3、BPBAac tool，以及其他T3SS效应蛋白文献资料，预测Cps T3SS效应蛋白编码基因。提取Cps6BC菌株DNA为模板，设计特异性引物，PCR扩增Cps T3SS假设效应蛋白编码基因，酶切后连接到载体pGEX-6P-1上，亚克隆构建重组质粒pGEX-6P-1/目的片段，经PCR、测序鉴定后转化至表达宿主菌E.coli BL21中，并进行IPTG诱导表达。对温度、IPTG浓度和时间等诱导表达条件进行系列优化后获得可溶性表达蛋白，并大量诱导表达，Western blot分析和鉴定表达产物。GST树脂纯化重组蛋白，BCA法测定蛋白浓度；重组蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，检测免疫小鼠血清中重组蛋白多克隆抗体的效价，并以制备的多克隆抗体为一抗，应用间接免疫荧光（Immunofluorescence assay, IFA）检测假设效应蛋白在感染细胞的定位情况，以筛选Cps效应蛋白。对筛选出来的效应蛋白，监测其在不同时间点的分泌情况，并用RT-PCR和Western blot分析其转录和蛋白表达时相。此外，Western blot分析效应蛋白与其他衣原体的血清的交叉反应。ELISA法检测效应蛋白刺激THP-1细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α的情况。 结果：应用Effective T3、BPBAac tool交叉验证，预测了9个Cps T3SS效应蛋白编码基因：CPSIT_0357、CPSIT_0429、CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0844、CPSIT_0846，并结合相关文献，选取了CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0968、CPSIT_0969、CPSIT_0942。培养Cps6BC48h后提取DNA，，扩增得到其目的片段；构建的重组质粒经PCR和测序证实插入片段为目的基因，测序结果与Genbank上登录序列完全一致；SDS-PAGE结果显示，在IPTG诱导下，对诱导表达条件进行系列的优化后，除CPSIT_0357、 CPSIT_0429、CPSIT_0968、CPSIT_0969外，重组菌分别表达了相对分子量（Mr）与预测分子量相近的可溶性蛋白。经GST树脂纯化后，将重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠，收集血清，检测其抗体效价：CPSIT_0785、CPSIT_0844、CPSIT_0846、CPSIT_0019、CPSIT_0020效价高达1:64000。IFA细胞内定位观察中，CPSIT_0844和CPSIT_0846位于包涵体膜，而CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0942位于包涵体内。CPSIT_0844、CPSIT_0846在Cps感染后0、6、12、18、24h后进行IFA监测，18h能观察到分泌于包涵体膜，并在随后的整个感染周期中位于包涵体膜。感染后2h即可在RT-PCR中检测到CPSIT_0846的mRNA的转录，而CPSIT_0844在12h检测到其转录，Western blot也显示了相同的结果，并随感染的时间而递增。CPSIT_0844、CPSIT_0846与Cps抗血清在相应条带有反应，而与肺炎嗜衣原体(Chlamydia pneumoniae，Cpn)和沙眼衣原体（Chlamydiatrachomati， Ct）抗血清无交叉反应。CPSIT_0844、CPSIT_0846能诱导THP-1细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α。 结论： 1. Effective T3、BPBAac tool信息学筛选T3SS效应蛋白，结合显微镜定位分析，对T3SS的研究具有指导性意义。 2. CPSIT_0844、CPSIT_0846位于包涵体膜，而CPSIT_0461、CPSIT_0463、CPSIT_0490、CPSIT_0594、CPSIT_0785、CPSIT_0019、CPSIT_0020、CPSIT_0942主要位于包涵体内。 3. CPSIT_0844、CPSIT_0846作为效应蛋白，在感染中期和早期发挥了一定的作用，体外能诱导THP-1细胞产生炎症因子。CPSIT_0844、CPSIT_0846与Cps抗血清有良好反应，而与Cpn、Ct抗血清无交叉反应。
【关键词】：生物信息学 鹦鹉热嗜衣原体 Ⅲ型分泌系统 效应蛋白 包涵体膜蛋白 时相表达 特异性
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R374.2
【目录】：

• 目录3-4
• 主要缩略语英文索引4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 实验材料15-17
• 实验方法17-32
• 实验结果32-47
• 讨论47-52
• 结论52-53
• 参考文献53-56
• 文献综述56-63
• 参考文献61-63
• 发表论文和著作63-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 梁之祥;;新发传染病研究概况[J];实用医药杂志;2010年10期

  本文关键词：鹦鹉热嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的预测、鉴定及特性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：329488