中缅边境恶性疟原虫对五种抗疟药的敏感性测定

发布时间：2017-04-27 20:10

  本文关键词：中缅边境恶性疟原虫对五种抗疟药的敏感性测定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 1.测定2007-2011年云南省中缅边境疟疾流行区佤邦以及2011年克钦邦恶性疟原虫对五种抗疟药咯萘啶、萘酚喹、甲氟喹、本芴醇和乙胺嘧啶的IC50(half maximal inhibitory concentration)值,并分析不同年份间药物敏感性的趋势。 2.利用巢式PCR扩增样本多药物抗性基因pfmdr1并进行序列测定、找出突变位点；比较佤邦和克钦邦基因位点的突变情况及两地区间的差异。 3.进一步优选和完善4℃冷藏方法条件以用于恶性疟原虫体外培养的同步化。 方法： 1.利用巢式PCR基因扩增方法,扩增恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein1, MSP1)和裂殖子表面蛋白2(merozoite surface protein2, MSP2)基因,鉴定2007-2011年间佤邦地区混合感染株。对确定的23例混合感染株及2011年克钦邦3例单一感染株,进行体外培养。对于佤邦样本,根据混合感染虫株间互相竞争的原理,判断长时间培养过程中是否能成为单一感染株。对单一株测定药物敏感性。 2.培养单一感染的疟原虫虫株,至环状体百分比70%、原虫感染率1%时,进行药物敏感试验。在96孔培养板中加入稀释好浓度梯度的抗疟药,调整原虫密度至0.5%,红细胞压积2%,加入96孔培养板中,放置于37℃、5%CO2培养箱中培养72小时,随后-20℃冻存。一周内,应用SYBR Green I体外荧光法,测其IC50值。用此方法分别测定23株佤邦样本和3株克钦邦样本对咯萘啶、萘酚喹、甲氟喹、本芴醇和乙胺嘧啶五种抗疟药的ICs0值。为了实验的准确性,每个药板中加入标准株作对照,每个样本重复三次。将测定出的荧光值整理、计算为原虫生长抑制率后输入统计学软件Prism5.0得出IC50值,95%可信区间及S型抗药曲线。小于或等于3D7标准株的IC50值的定为敏感,大于抗性临界IC50值的为敏感性降低。按此标准分析数据,得出佤邦地区2007-2011年的抗药性趋势。 3.测定佤邦和克钦邦样本的pfmdrl基因序列,找出突变位点,分析两地区pfmdrl基因位点突变情况差异,并进行统计学检验。 4. Percoll-Sorbitol梯度纯化法获得疟原虫裂殖体,并通过4℃冷藏法验证裂殖体是否能够耐受4℃低温,为该同步化方法的原虫时期选择和状态判断奠定基础。分别记录4℃同步化前后4株标准株和4株病人株环状体的感染率,每株样本重复三次,分析标准株和病人株同条件下(4℃冷藏处理)有无统计学差异。用4℃同步化分别处理标准株3D7三个不同环状体感染率区间(30-50%,50-70%,70%),观察同步化的效果,统计学分析此同步化方法对不同环状体感染率影响有无差异。 结果： 1.佤邦23株混合感染病人株经培养后变为单一株的,在第20天有5株；第30天有8株；第40天有8株；第50天有1株；第90天有1株。 2.佤邦地区23株(2007-2011)和克钦邦3株(2011)样本对五种抗疟药的体外敏感IC50值为：咯萘啶(3.2±1.8nM)、萘酚喹(5.9±4.0nM)、甲氟喹(51.6±33.7nM)、本芴醇(2.4±1.5nM)和乙胺嘧啶(2907.1±2109.3nM)。统计学检验分析说明疟原虫对五种药的敏感率不同(P0.005),对咯萘啶、萘酚喹、甲氟喹和本芴醇仍为敏感,而对乙胺嘧啶已有严重抗性,且抗性随年份逐渐增加,2010年抗性率均已达100%。单独对克钦邦2011年3株样本的ICs0值分析,发现其对五种抗疟药均为敏感或敏感度轻微下降。对佤邦年份间抗药性分析比较发现对咯萘啶、甲氟喹和乙胺嘧啶的敏感性年份间没有统计学差异;对萘酚喹和本芴醇的敏感性年份间有统计学差异,但都只限于一个年份有抗性株的出现,其余三个年份敏感率均为100%。 3.在pfmdrl测序的38株样本中(960bp片段有两个样本未测序成功),佤邦样本有21株,克钦邦样本有17株。其中12株佤邦样本和8株克钦邦样本有突变位点。第86氨基酸位点突变的样本有8株(突变率21.1%),其中7株来自佤邦,1株来自克钦邦。第130氨基酸位点突变的样本有3株(突变率7.9%)均来自佤邦。第184氨基酸位点突变的样本有8株(突变率21.1%),其中6株来自克钦邦,2株来自佤邦。第1042氨基酸位点突变的仅有1株(突变率2.8%),来自佤邦。克钦邦样本F08B35发现一个新的突变位点173(突变率2.6%)。仅有一株佤邦样本(WBLH5)有两个点突变,突变型为Y184F/N1042D。另外19株为单一位点突变,剩余18株为野生型。经统计学分析,佤邦和克钦邦地区突变率差异不显著(χ2=0.38,0.5P0.75)。 4.对疟原虫低温冷藏同步化实验发现,裂殖体不耐受4℃低温冷藏。对环状体百分比在37.5-44.1%之间的虫株,冷藏9-24h后,可达到77.0-85.6%环状体,且重复性较好。统计学分析同步化前后标准株和病人株环状体百分比变化,P=0.194,说明两种虫株经过4℃同步化处理后环状体率无显著差异。4℃同步化处理三个不同环状体百分比区间的标准株3D7,统计学分析说明不同环状体感染率疟原虫经4℃同步化处理后效果无显著性差异(F=1.990,P=0.217)。 结论： 1.混合感染株经一段时间的培养,可以逐渐变为单一感染株。而且大部分在40天内变为单一株。 2.佤邦地区(2007-2011)恶性疟原虫对咯萘啶、萘酚喹和甲氟喹仍为敏感,但敏感性有所下降;对本芴醇总体看仍为敏感,但对乙胺嘧啶已有严重抗性,2010年抗性率为100%。克钦邦地区(2011)对五种抗疟药仍较敏感,只有个别虫株敏感性轻微下降。 3.佤邦和克钦邦两个疟疾流行区的pfmdr1位点突变率没有统计学差异。基因突变型百分率按从大到小排列为：N86Y=Y184FG130KN1042DN173K。 4.对培养的疟原虫4℃冷藏可以杀灭裂殖体。4℃冷藏同步化法操作简单,降低了污染的可能性,可以达到药敏试验的选虫标准,其同步化效果和山梨醇同步化法相似。病人株和标准株经4℃同步化处理后均可达到预期效果；不同环状体感染率(30%)疟原虫经4℃同步化处理后效果没有统计学差异。
【关键词】：恶性疟原虫 pfmdr1基因 抗药性 4℃同步化法 IC_(50)
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.31
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-19
• 实验材料与方法19-42
• 1 实验材料19
• 2 实验仪器、试剂来源及配制19-24
• 3 试验方法与步骤24-42
• 结果42-54
• 1 混合感染株经培养变为单一感染株的记录结果42-43
• 2 pfmdr1基因扩增结果43-46
• 3 五种抗疟药的IC_(50)值测定结果及虫株抗药性分析46-51
• 4 4℃冷藏同步化实验结果51-54
• 讨论54-57
• 1 分子技术在实验中的应用54-55
• 2 抗药性测定和IC_(50)值55-56
• 3 交叉抗药性56
• 4 4℃冷藏同步化法56-57
• 结论57-58
• 实验创新性58-59
• 参考文献59-63
• 综述63-71
• 参考文献67-71
• 硕士在读期间发表文章71-72
• 致谢72

【参考文献】

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1 张苍林;周红宁;王剑;刘慧;;中缅边境地区恶性疟原虫对氯喹、哌喹、咯萘啶敏感性的体外测定[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2012年01期

  本文关键词：中缅边境恶性疟原虫对五种抗疟药的敏感性测定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：331342