人红系终末分化中不同期幼稚细胞的分离和功能研究

发布时间：2021-08-26 13:39

　　红血球的生成,是造血干细胞定向往红细胞发育,成熟的过程,是一个连续而又具有阶段性的过程。血型糖蛋白A的出现表示红系终末分化的开始,细胞从原成红细胞开始向嗜碱性幼红细胞,嗜多色性幼红细胞,正染色幼红细胞增殖分化,最后细胞脱核后变成网织红细胞。网织红细胞经过成熟变成成熟红细胞后通过骨髓进入血液循环系统。本文建立了一个稳定的模拟红系体内发育的培养体系,并运用蛋白质印迹实验和流式细胞学分析法检测了数十种红系发育相关的膜表面蛋白,骨架蛋白以及跨膜蛋白在培养过程中表达水平的变化。实验结果表明,Band3在发育过程中上升的幅度最为明显而α4integrin,一种粘附分子,先是保持高表达水平,而后降至最低。我们选取了Band3和a4integrin这两个变化最大的膜蛋白作为标记物,搭配血型糖蛋白A,红系的特异性标记物,对我们的培养体系的分化过程进行了监测,并选取了第7天和第14天的细胞进行流式细胞分选。我们在第7天的细胞中得到了具有形态学特征的原成红细胞,早期嗜碱性幼红细胞,晚期嗜碱性幼红细胞和嗜多色性幼红细胞,我们在第十四天的细胞中得到了具有形态学特征的嗜多色性幼红细胞和正染色幼红细胞,流式细胞分选... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：73 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写词简表
前言
第一章 红系发育培养系统的建立
    1.1 材料
        1.1.1 细胞培养试剂
        1.1.2 细胞来源
        1.1.3 CD34~+干细胞分离设施和试剂
        1.1.4 细胞离心涂片及Giemsa染色设备
        1.1.5 主要仪器
        1.1.6 缓冲液的配制
    1.2 方法
        1.2.1 CD34~+干细胞分离
        1.2.2 CD34~+细胞培养
        1.2.3 细胞离心涂片制备
        1.2.4 Giemsa染色
    1.3 结果
        1.3.1 细胞发育中的形态的观察
        1.3.2 细胞在21天培养系统中的生长情况
    1.4 讨论
第二章 红细胞膜蛋白在发育中的变化
    2.1 材料
        2.1.1 抗体纯化以及标记荧光试剂
        2.1.2 蛋白质印迹所用抗体
        2.1.3 流式细胞学分析法所用抗体
        2.1.4 蛋白质印迹相关设备
        2.1.5 流式细胞学分析法相关设备
    2.2 方法
        2.2.1 抗体的纯化以及荧光标记
        2.2.2 蛋白质印迹方法
        2.2.3 流式细胞学分析法
    2.3 结果
        2.3.1 通过蛋白质印迹法对膜蛋白和骨架蛋白的分析
        2.3.2 人红系发育终末分化中膜表面蛋白的变化
    2.4 讨论
第三章 用Band3和α4 integrin作为标记物来对体外培养中红系终末分化的分析以及根据这两个标记物将红系终末发育的五个期的分选
    3.1 材料
        3.1.1 细胞培养
        3.1.2 流式细胞学分析
        3.1.3 流式细胞学分选的仪器和分析软件
        3.1.4 流式分析以及流式分选所用的抗体
        3.1.5 细胞离心涂片以及Giemsa染色
    3.2 方法
        3.2.1 用双标记物对培养的细胞进行分析
        3.2.2 荧光激活的流式细胞分选
        3.2.3 细胞离心涂片和Giemsa染色
    3.3 结果
        3.3.1 用不同的组合对红系终末分化发育的比较以及最终确定Band3和α4integrin为标记物
        3.3.2 流式细胞分选出在培养的CD34~+阳性的细胞中的不同期的细胞
    3.4 讨论
第四章 体外培养细胞的有丝分裂能力和不同期细胞表面蛋白的表达水平
    4.1 材料
        4.1.1 流式分选过的细胞的培养材料
        4.1.2 洗脱抗体的材料
        4.1.3 流式细胞分选所用抗体
        4.1.4 抗体洗脱后再染色时用的抗体
    4.2 方法
        4.2.1 流式细胞学分选
        4.2.2 流式细胞分选后的不同期细胞的培养以及细胞计数
        4.2.3 抗体洗脱
        4.2.4 抗体洗脱后的细胞染色
    4.3 结果
        4.3.1 红系终末分化中不同期的有丝分裂能力
        4.3.2 洗脱流式细胞分选的细胞上的抗体以及重新染色对其进行流式细胞分析
    4.4 讨论
第五章 正常人骨髓中红系发育终末分化的研究以及人骨髓中幼稚细胞的流式细胞分选
    5.1 材料
        5.1.1 正常人骨髓的来源
        5.1.2 流式细胞分析所用的抗体
        5.1.3 流式细胞分选所用的抗体
        5.1.4 骨髓中CD45~+细胞消除的相关试剂以及设备
        5.1.5 细胞离心涂片以及Giemsa染色制备的设备
        5.1.6 流式细胞分析仪器和软件
        5.1.7 流式细胞分选仪器和软件
    5.2 方法
        5.2.1 正常人骨髓中单核细胞的分离
        5.2.2 骨髓中CD45~+细胞的消除
        5.2.3 骨髓细胞流式学分析
        5.2.4 骨髓流式细胞学分选
        5.2.5 细胞离心涂片和Giemsa染色
    5.3 结果
        5.3.1 对于人骨髓的流式细胞学分析以及不同期细胞的划分策略
        5.3.2 正常人骨髓的流式细胞分选以及细胞形态
        5.3.3 对人正常骨髓中红系发育的各个期进行统计学分析
    5.4 讨论
第六章 骨髓异常增生综合症病人红系发育的异常发生
    6.1 材料
        6.1.1 骨髓异常增生综合症的病人骨髓来源
        6.1.2 流式细胞分析所用的抗体以及仪器设备
        6.1.3 骨髓中CD45~+细胞消除的相关试剂以及设备
    6.2 方法
        6.2.1 骨髓异常增生综合症的骨髓中单核细胞的分离方法
        6.2.2 骨髓异常增生综合症中单核细胞中CD45+细胞的消除法
        6.2.3 骨髗异常增生综合症中红系细胞的流式细胞学染色
    6.3 结果
        6.3.1 骨髓异常增生综合症的病人的骨教中红系发育异常
    6.4 讨论
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间主要研究成果
致谢



本文编号：3364341