随机RNA文库技术的建立及其应用

发布时间：2021-09-28 12:05

　　指数式富集的配体系统进化（SELEX）技术是近年来发展起来的研究核酸结构、功能及进化的一种新的组合化学技术。它在基础医学、临床诊断及药物筛选方面具有广泛的应用前景。本研究的目的是建立并完善随机RNA文库技术，并筛选牛凝血酶和噬菌体末端酶大亚基gp16特异结合的抑制性RNA配基，为新型药物筛选及抗病毒研究提供理论基础及实验依据。 本研究利用基因工程方法在大肠杆菌表达并纯化了T7RNA聚合酶，该酶具有很好的体外转录活性。1mg纯化的T7RNA聚合酶相当于250U Promega产品。我们采用全长68nt，随机区由25个碱基构成的RNA文库，筛选获得了与牛凝血酶特异结合的配基。配基高度富集为2条序列，它们与牛凝血酶的亲和力较高，解离常数分别为164nmol／L和240nmol／L。RNA配基能够体外抑制牛凝血酶的催化酶切活性，是作用在牛凝血酶的肝素结合位点上。对其进行结构分析表明，随机区形成的茎环结构是其发挥活性的结构基础。针对配基的基础结构设计并筛选到能够迅速逆转RNA配基生物活性的反义寡核苷酸拮抗剂。在以上研究工作基础上，又筛选了在噬菌体Φ29的基因组DNA组装过程中起重要作用的末... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：93 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

IAT7RNA聚合酶表达定图

TT测定:录酶为阳性对照，设计以下实验判定我们表表1.1体外转录样品成分123ll4(Promega)64(Promega)62(Promega)644(自配)6466

6一8:与人凝血酶、牛纤维蛋白原、胃蛋白酶结合情况由放射自显影图可见，经过7轮筛选后的RNA只与牛凝血酶结合，而不与人酶、牛纤维蛋白原及胃蛋白酶等无关蛋白结合。并且RNA配基与牛凝血酶的呈剂量效应关系，即随着牛凝血酶的量的增加与其结合的RNA也增加。RNA配基的克隆、测序第7轮筛选出的RNA配基，经反转录成DNA，回收纯化后连接到T载体中，克隆。随机挑取23个克隆测序。测序结果显示，21个克隆的序列是一致的;2个克隆序列是相同的。分别将它们命名为T705RNA和T7lORNA。RNA:AUGGUACGGUACUUCCUUUGGAAGAUAGCUGGAGAACUAACCAAAACACGCUACUUUGCUAARNA:AUGGUACGGUACUUCCAAGUGCGGGGGGGAGGUGGUGGUUCCAAAACACGCUACUUUGCUAA线部分为随机区。

【参考文献】：
期刊论文
[1]随机RNA文库的构建[J]. 杨光,邵宁生,柳川.  军事医学科学院院刊. 2000(03)



本文编号：3411865