人博卡病毒（HBoV1）非结构蛋白NP1基因功能的研究

发布时间：2021-10-13 17:46

　　人博卡病毒（Human bocavirusl, HBoV1）是从下呼吸道感染幼儿样本中检测到的一种新细小病毒。全基因序列分析表明,该病毒与牛细小病毒（BPV）、犬细小病毒（MVC）及新发现的猪博卡病毒（PBoV）,归属于细小病毒亚科博卡病毒属。众多研究表明,HBoV1在世界范围内引起儿童下呼吸道感染,患者主要是2岁以下婴幼儿,临床症状主要表现急性呼吸道哮喘和肺炎。随后另三种不同基因型HBoV2、HBoV3和HBoV4在胃肠道疾病患者的粪便中发现,表明博卡病毒不仅是呼吸道感染的病原体,还可能还会引发病毒性肠胃炎疾病。HBoV1基因全长约5.5kb,两个主要的开放阅读框分别编码非结构蛋白NS1和衣壳蛋白VP1和VP2,同时还有第三个阅读框编码非结构蛋白NP1。NP1为博卡病毒属所特有,序列高度保守,博卡病毒属成员HBoV1、BPV和MVC的NP1蛋白氨基酸序列同一性达47%。由于缺乏传统体外培养系统和动物模型,对人类博卡病毒的研究多集中于流行病学,而在HBoV1的分子生物学及病毒致病机制的研究报道甚少。因此本文主要针对HBoV1特有蛋白NP1功能展开研究,为阐明蛋白在HBoV1致病机理提供... 

【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 引言
    1.2 细小病毒科简介
    1.3 人博卡病毒简介
        1.3.1 人博卡病毒的生物特性及诊断方法
        1.3.2 人博卡病毒的流行病学特性
        1.3.3 人博卡病毒与其他病毒共感染的特性
        1.3.4 人博卡病毒感染的临床症状
    1.4 人博卡病毒的分子生物学特性
        1.4.1 人博卡病毒基因组特征
        1.4.2 人博卡病毒转录翻译机制研究
        1.4.3 人博卡病毒蛋白基因功能研究
    1.5 细小病毒与细胞死亡及细胞阻滞
        1.5.1 红细胞病毒属—B19
        1.5.2 博卡病毒属—HBoV、MVC、BPV
        1.5.3 水貂阿留申病病毒属—AMDV
        1.5.4 依赖病毒属—AAV
        1.5.5 细小病毒属—MVM、H-1PV
    1.6 细胞转录因子及炎症因子
        1.6.1 NF-κB
        1.6.2 STAT家族
        1.6.3 AP-1
        1.6.4 TNF-α
        1.6.5 IL-6
    1.7 CHECKMATE~(TM)哺乳动物双杂交系统简介
    1.8 T7噬菌体展示技术简介
    1.9 研究目的和意义
第二章 人博卡病毒非结构蛋白NPl诱导HELA细胞阻滞及细胞凋亡
    2.1 材料与方法
        2.1.1 载体、菌株与细胞系
        2.1.2 主要试剂与仪器
        2.1.3 重组表达质粒的构建
        2.1.4 转染(脂质体介导转染法)
        2.1.5 免疫荧光与Western blotting
        2.1.6 DAPI与JC-1染色
        2.1.7 流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期
        2.1.8 酶活性分析
    2.2 实验结果
        2.2.1 目的蛋白NP1在Hela细胞中表达
        2.2.2 NP1诱导Hela细胞周期阻滞和细胞凋亡
        2.2.3 NP1诱导细胞依赖于caspase活性的细胞凋亡
        2.2.4 NP1通过线粒体途径诱导细胞凋亡
        2.2.5 NP1的N末端对细胞凋亡起至关重要的作用
    2.3 讨论
第三章 人博卡病毒非结构蛋白对细胞转录因子调控分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 重组表达质粒的构建
        3.1.3 免疫荧光和Western blot分析
        3.1.4 荧光素酶双报告基因活性测定
        3.1.5 ELISA和实时荧光定量PCR检测IL6和TNF-α的表达
        3.1.6 哺乳动物双杂交实验
        3.1.7 统计学分析
    3.2 结果
        3.2.1 重组表达载体的构建
        3.2.2 目的蛋白在293T细胞中的表达
        3.2.3 HBoV1 NP1上调转录因子AP-1、STAT3及STATl的活性,对NF-κB活性无影响
        3.2.4 NP1对炎症因子IL-6和TNF-α表达的影响
        3.2.5 单独表达的NP1蛋白不存在自身相互作用
        3.2.6 HBoV1 NS1上调转录因子AP-1、STAT3及NF-κB的活性,对STAT1活性无影响
    3.3 讨论
第四章 人博卡病毒非结构蛋白NP1核定位信号分析
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 重组表达质粒的构建
        4.1.3 转染、荧光显微镜观察
        4.1.4 免疫荧光与Western blotting
    4.2 实验结果
        4.2.1 NP1融合蛋白的表达及细胞定位
        4.2.2 NP1 C末端和两端截短定位情况
        4.2.3 NP1 N末端截短蛋白在细胞中的定位
        4.2.4 NP1突变蛋白定位情况
    4.3 讨论
第五章 人博卡病毒非结构蛋白NP1与宿主细胞相互作用蛋白筛选
    5.1 材料和方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 引物的设计及合成
        5.1.3 原核表达载体的构建
        5.1.4 pMAL-NP1的诱导表达及条件优化
        5.1.5 融合蛋白MBP-NP1的纯化
        5.1.6 BCA法测定蛋白浓度(碧云天试剂盒)
        5.1.7 T7噬菌体文库扩增及空斑测定噬菌体滴度
        5.1.8 噬菌体的生物筛选
        5.1.9 竞争性洗脱特异性结合的噬菌体
        5.1.10 噬斑的PCR扩增
        5.1.11 克隆载体的构建和鉴定
        5.1.12 DNA序列测序及同源性比对
    5.2 实验结果
        5.2.1 融合蛋白MBP-NP1的诱导表达及条件优化
        5.2.2 融合蛋白MBP-NP1的纯化
        5.2.3 扩增后T7人肝cDNA文库多样性分析
        5.2.4 噬菌体生物淘选结果
        5.2.5 目的基因PCR扩增、序列比对及同源性分析
        5.2.6 测序数据分析
    5.3 讨论
结论
参考文献
攻读博士学位期间论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[2]噬菌体展示技术在蛋白质研究中的应用[J]. 李珣,任珍珍,钟国华.  生命的化学. 2009(04)
[3]噬菌体展示技术及其应用[J]. 刘相叶,邓洪宽,吴秀萍,王学林,于申业,于艳玲,刘明远.  动物医学进展. 2008(01)
[4]WLL-1株博卡病毒（Bocavirus）基因组测序及生物信息学分析[J]. 林峰,曾爱平,杨恩,林海燕,郑昌华,陈弘,李桦,李旭阳,郁明素,杨宁敏,金大智,余光创,伯晓晨,文思远,王升启.  浙江检验医学. 2007(01)
[5]WLL-1株博卡病毒（Bocavirus）全基因组序列分析[J]. 林峰,曾爱平,杨恩,林海燕,郑昌华,陈弘,李桦,李旭阳,郁明素,杨宁敏,金大智,余光创,伯晓晨,文思远,王升启.  病毒学报. 2007(01)
[6]儿童急性呼吸道博卡病毒感染[J]. 瞿小旺,漆正宇,段招军,刘劲松,刘巧突,刘文培,黄灿平,谢志萍,彭夫望,高寒春,郑丽舒,侯云德.  病毒学报. 2006(02)



本文编号：3435123