志贺菌中CRISPR的分布及其结构特征

发布时间：2017-05-05 19:09

  本文关键词：志贺菌中CRISPR的分布及其结构特征，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：志贺菌属细菌是急性感染性腹泻的主要病原体之一，由志贺菌引起的细菌性痢疾的发病率居我国感染性腹泻病首位。随着抗生素的广泛使用，志贺菌的耐药现象越来越普遍，已成为严重的公共卫生问题，耐药基因的水平转移是细菌耐药性增强的主要方式之一。 成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat, CRISPR）是近年来发现的与细菌横向基因转移有密切关系的一个遗传结构，能够有效地防御基因的水平转移。因此了解细菌中CRISPR的存在与否及其特征，对于探讨细菌耐药状况及其机制，尤其了解细菌横向基因转移情况具有重要意义。而CRISPR在志贺菌中的分布情况未见报道。 本课题检测实验室保存的志贺菌CRISPR系统相关基因并测序，分析志贺菌中CRISPR的分布情况及其特征，为进一步揭示志贺菌横向基因转移规律及其与细菌耐药等特性的关系提供基础资料。 研究方法 对196株志贺菌进行生化鉴定，，其中江西分离株9株，河南分离株176株，北京分离株5株，中国药品检定所6株；K-B纸片法进行药敏试验；PCR扩增志贺菌CRISPR相关序列；DNA测序，并对核苷酸序列进行分析；采用随机引物法标记制作探针，斑点杂交。 结果 1.在196株志贺菌株中均检测出cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因。以志贺菌分离时间的中位数2004年为分界点分为两组，其中CRISPR-S1、CRISPR-S4在两组之间的分布差异有统计学意义；而CRISPR-S2、CRISPR-S3在两组的分布没有差异。 2.在90株志贺菌中共检出260条间隔序列，与CRISPR DB数据库比对，207条是已有的志贺菌间隔序列，另外53条是新发现的志贺菌间隔序列。 3.志贺菌CRISPR同一个位点的重复序列相对保守，有的重复序列在5'端或3'端会出现碱基缺失和变异。 4. BLAST发现与cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因高度同源的细菌包括志贺菌和大肠杆菌。志贺菌CRISPR系统的重复序列和间隔序列在CRISPR DB数据库BLAST，与大肠杆菌、沙门氏菌中甚至一些亲缘关系较远的菌株同源性较高。 5.选取3株志贺菌进行cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因测序，测序结果与GenBank上公布的含有CRISPR的Shigella sonnei53G进行比对，发现cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因均有不同程度的差异，进一步做药敏试验，发现cas2基因的差异和细菌耐药程度存在关联。 6.设计出志贺菌cas基因和重复序列探针，地高辛标记后与志贺菌基因组DNA进行斑点杂交，产生杂交信号。 结论 1. CRISPR系统在志贺菌中广泛存在；不同时间分离的志贺菌的CRISPR位点S1和S4分布有差异。 2. Cas2基因差异与志贺菌耐药程度有关。 3.志贺菌CRISPR系统与大肠杆菌的同源性较高。 4.设计出志贺菌CRISPR系统相关的PCR引物；实现了志贺菌CRISPR系统的探针制备及杂交方法的建立。
【关键词】：志贺菌 耐药 CRISPR 系统 斑点杂交
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378;R3416
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-11
• 图表索引11-12
• 英文缩略词12-13
• 1 引言13-15
• 2 材料与方法15-26
• 2.1 实验材料15-20
• 2.1.1 菌株来源15
• 2.1.2 主要试剂15-17
• 2.1.3 主要试剂配方17-18
• 2.1.4 生物信息学软件18
• 2.1.5 网络服务器18
• 2.1.6 主要设备及仪器18-20
• 2.2 实验方法20-26
• 2.2.1 腹泻标本采集、运送、包装、保存20
• 2.2.2 志贺菌的分离和鉴定20-21
• 2.2.3 改良 Kirby-Bauer（K-B）法进行药敏试验21-22
• 2.2.4 核酸序列分析22
• 2.2.5 引物设计22-23
• 2.2.6 PCR 扩增和凝胶电泳23
• 2.2.7 寡核苷酸探针设计23
• 2.2.8 地高辛标记志贺菌 cas2 基因的 DNA 探针及标记效率的检测23-24
• 2.2.9 斑点杂交24-26
• 3 结果26-53
• 3.1 志贺菌中 CRISPR 系统的分布26-30
• 3.1.1 志贺菌 cas1、cas2 基因的分布26
• 3.1.2 志贺菌 CRISPR 位点的检测26-30
• 3.1.3 志贺菌 CRISPR 位点的分布30
• 3.2 CRISPR DB 数据库中志贺菌的 CRISPR 信息30-34
• 3.3 实验室保存的志贺菌 CRISPR 系统的结构特征34-43
• 3.3.1 志贺菌 cas1、cas2 基因核苷酸测序结果分析34
• 3.3.2 志贺菌 CRISPR 位点测序结果分析34-37
• 3.3.3 志贺菌 CRISPR 系统重复序列的结构特征37-38
• 3.3.4 志贺菌 CRISPR 系统间隔序列的结构特点38-43
• 3.4 志贺菌 CRISPR 系统的同源序列43-46
• 3.4.1 志贺菌的 cas1 基因和 cas2 基因的同源序列43-44
• 3.4.2 志贺菌 CRISPR 系统的重复序列的同源序列44
• 3.4.3 志贺菌 CRISPR 系统的间隔序列的同源序列44-46
• 3.5 志贺菌 CRISPR 系统和耐药关系的初步探索46-50
• 3.5.1 志贺菌 cas 基因的差异46-49
• 3.5.2 志贺菌药敏结果49-50
• 3.6 志贺菌 CRISPR 系统相关基因的斑点杂交50-53
• 3.6.1 志贺菌 cas2 基因的斑点杂交50-51
• 3.6.2 志贺菌 CRISPR 系统重复序列的斑点杂交51-53
• 4 讨论53-59
• 4.1 志贺菌中 CRISPR 系统的分布53-54
• 4.1.1 志贺菌中 CRISPR 相关基因 cas1 和 cas2 的分布53
• 4.1.2 志贺菌中 CRISPR 位点的分布53-54
• 4.2 志贺菌中 CRISPR 系统重复序列的特点54-55
• 4.3 志贺菌中 CRISPR 系统间隔序列的特点55-56
• 4.4 志贺菌中 CRISPR 系统的同源序列56-57
• 4.5 志贺菌 CRISPR 系统与耐药关系的探讨57-58
• 4.6 志贺菌 CRISPR 系统相关基因的斑点杂交58-59
• 5 结论59-60
• 参考文献60-63
• 综述63-77
• 参考文献72-77
• 个人简历、攻读硕士期间发表论文及研究成果77-78
• 致谢78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 方锐;畅飞;孙照霖;李宁;孟庆勇;;CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J];生物化学与生物物理进展;2013年08期

2 李铁民;杜波;;CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J];遗传;2011年03期

3 宋春花;黄学勇;郗园林;张梅喜;段广才;;志贺菌敏感株与基因转移耐多药株蛋白组学分析[J];中国公共卫生;2008年01期

4 赵晨;王辂;;噬菌体治疗——旧概念,新阶段[J];微生物学通报;2011年11期

5 Chuanxian Wei;Jiyong Liu;Zhongsheng Yu;Bo Zhang;Guanjun Gao;Renjie Jiao;;TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J];遗传学报(英文版);2013年06期

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本文编号：346937