表皮细胞培养中维持干细胞特性相关技术的研究

发布时间：2021-11-14 12:25

　　目的：（1）利用流式细胞仪检测表皮细胞整合素β1亚基（CD29）和增殖细胞核抗原（PCNA）的荧光标记强度，建立简便易行的表皮干细胞检测方法。（2）利用该检测手段，通过优化表皮细胞分离、培养条件，以提高培养表皮细胞中的干细胞数量。（3）构建人整合素β1基因重组腺病毒载体，转染表皮细胞，观察其生物学特征的改变，为进一步皮肤组织工程研究提供理论基础和研究手段。方法：（1）分离表皮细胞，通过粘附选择富集表皮干细胞和短暂扩充细胞，观察细胞克隆形成率，流式细胞仪检测表皮细胞CD29和PCNA、荧光免疫组织化学检测BrdU的荧光标记强度，分析上述指标间的相关性。（2）利用L16（4⁴）正交表设计试验，选择原代培养消化过程中Dispase Ⅱ酶与胰蛋白酶不同浓度和作用时间，以及无血清培养基中EGF、胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松的不同浓度为实验因素，考察表皮细胞生物学性状和其中CD29⁺／PCNA^-细胞的比例，优化最佳分离和培养条件。（3）利用AdeasyTM系统构建含ITG-β1基因片段的重组腺病毒载体，转染人原代培养表皮细胞，观察细... 

【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市 211工程院校

【文章页数】：90 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

不同粘附选择时间富集细胞形成克隆的大小A粘附选择10min，B粘附选择10h

2.2表皮干细胞检测指标的比较粘附选择10min所获得的干细胞为主的表皮细胞中CD29冲CNA一的比例约为67%(见图)，而已TA为主的细胞中仅有1429%，荧光染色见图2;而BrdU在这两群细胞中的阳性率分别为58.57%和9.84%(见表2、图3);细胞周期分析显示GO/GI、S的比例在两群细胞中也有显著的差异(见表3、图4)。经相关分析，CD29+PCNA一与Brd了及细胞周期分析间具有良好的相关性(r值分别为0.94和0.87)。表2富集的不同表皮细胞CD29+PCNA一细胞比例的变化CD29+PCNA一细胞比例粘附选择时间—即刻培养7天粘附10min67.33士13.5614.29士4.25粘附10h41.92士11.329.61士2.87

粘附选择10min所获得的干细胞为主的表皮细胞中CD29冲CNA一的比例约为67%(见图)，而已TA为主的细胞中仅有1429%，荧光染色见图2;而BrdU在这两群细胞中的阳性率分别为58.57%和9.84%(见表2、图3);细胞周期分析显示GO/GI、S的比例在两群细胞中也有显著的差异(见表3、图4)。经相关分析，CD29+PCNA一与Brd了及细胞周期分析间具有良好的相关性(r值分别为0.94和0.87)。表2富集的不同表皮细胞CD29+PCNA一细胞比例的变化CD29+PCNA一细胞比例粘附选择时间—即刻培养7天粘附10min67.33士13.5614.29士4.25粘附10h41.92士11.329.61士2.87

【参考文献】：
期刊论文
[1]表皮细胞培养最佳条件的探索[J]. 刘杰,王德文,崔雪梅.  军事医学科学院院刊. 2001(04)
[2]表皮细胞生长因子治疗创面出现的干细胞岛现象[J]. 付小兵,孙晓庆,孙同柱,董永洪,顾小曼,陈伟,盛志勇.  中华医学杂志. 2001(12)
[3]Dispase Ⅱ和胰酶消化法分离大鼠皮肤角朊细胞的对比研究[J]. 崔正军,陈璧,汤朝武,姜笃银.  第四军医大学学报. 1998(03)
[4]混合培养自体与异体表皮细胞的移植方法[J]. 苏波,俞为荣,朱世辉,唐洪泰,夏照帆,葛绳德.  第二军医大学学报. 1997(01)
[5]增殖细胞核抗原的研究进展[J]. 黄杰雄.  国外医学(生理、病理科学与临床分册). 1994(01)



本文编号：3494634