外源p204对斑马鱼先天免疫的影响和p204转基因载体的构建

发布时间：2017-05-07 10:05

  本文关键词：外源p204对斑马鱼先天免疫的影响和p204转基因载体的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：天然免疫和适应性免疫共同组成一了动物的免疫系统。天然免疫是机体防御病原微生物感染的第一道防线,在天然免疫系统中最重要的一环就是模式识别受体PRRs对病原微生物模式相关分子PAMPs的识别。TLR是重要的胞外和胞内受体,参与到NF-κB和IRF激活的信号通路,引起机体的炎症反应和抗病毒反应。天然免疫和适应性免疫不是独立的两个系统,相反,天然免疫的重要分子和信号通路可以激活适应性免疫。在这个机制中,TLRs信号通路是联系天然免疫与适应性免疫的纽带。 斑马鱼与人类一样具有天然免疫和适应性免疫。对斑马鱼适应性免疫系统的研究已有多年,取得了重要的研究成果,研究技术也有很大的提高。然而,对斑马鱼天然免疫系统的研究才刚刚起步。天然免疫系统是机体防御病原微生物感染的第一道防线,而且对适应性免疫系统的激活有重要的影响。因此在斑马鱼中深入研究天然免疫系统不仅可以促进我们对斑马鱼自身的免疫系统的认识,而且从进化的角度看,也为研究高等脊椎动物免疫系统提供思路和工具。并且斑马鱼因其个体小、易于饲养、性成熟周期短、易繁殖和繁殖率高、胚胎透明易观察、便于胚胎操作等优势,现已广泛应用于基因功能的相关研究。 本研究以斑马鱼为动物模型,采用显微注射的方式将外源的p204质粒导入斑马鱼受精卵中,通过观察报告基因GFP的荧光表达,发现p204在斑马鱼胚胎中从8hp研始表达,表达位置主要集中载斑马鱼的胸腹部,在8hpf-8dpf时期p204大量表达,8dpf后p204的表达量会逐渐减少,直至11dpf右发现荧光完全消失。p204-EGFP质粒注射后导致斑马鱼表型变化,产生畸形,出现腹部变大、尾部弯曲等状况。 对注射后的斑马鱼胚胎,选取其中表达绿色荧光的胚胎进行实时定量PCR检测,检测先天免疫相关的基因tbk1和sting,通过实时定量检测,发现p204注射后能够引起相应的先天免疫相关基因tbkl和sting表达量在8hpf-48hpf阶段比对照组都有明显上调,而之前4hp阶段段的表达量并没有明显变化。另外进行了相应基因的原位杂交检测,其结果与实时定量结果相吻合。为了能够获得p204整合进入斑马鱼基因组中的突变体,我们利用tol2转座子携带p204,构建tol2-p204的载体,并将其和TP转座酶一起共注射到斑马鱼受精卵中。研究结果表明：1外源p204基因可以在一定程度上影响斑马鱼的发育,造成斑马鱼的畸形；2.p204能够影响斑马鱼先天免疫,参与相关信号通路；3.tol2-p204载体构建成功,并且导入斑马鱼受精卵中,但p204在斑马鱼体内的表达不够稳定。本研究为进一步以斑马鱼为模式动物研究先天免疫相关分子机制和掰马鱼与哺乳动物先天免疫信号途径的进化关系提供了新的依据。
【关键词】：斑马鱼 先天免疫 p204 tbk1 sting TLR
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;Q782
【目录】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符号说明10-11
• 1. 前言11-19
• 1.1 p204的生物学作用11-12
• 1.2 脊椎动物先天免疫简介12-14
• 1.3 斑马鱼作为模式动物的优势14
• 1.4 斑马鱼先天免疫相关信号通路14-16
• 1.5 斑马鱼研究常用技术16-17
• 1.5.1 斑马鱼转基因技术16
• 1.5.2 突变体技术16-17
• 1.5.3 胚胎原位杂交技术17
• 1.5.4 基因过表达技术17
• 1.6 Tol2转座子的应用17
• 1.7 研究思路和意义17-19
• 2. 实验材料与方法19-48
• 2.1 实验材料试剂与仪器19-24
• 2.1.1 主要实验试剂19-23
• 2.1.2 实验动物23
• 2.1.3 主要实验仪器23-24
• 2.2 方法24-48
• 2.2.1 斑马鱼的饲养与繁殖24-25
• 2.2.2 p204-EGFP质粒的扩增与线性化25-29
• 2.2.3 显微注射29-30
• 2.2.4 胚胎发育荧光观察和统计30
• 2.2.5 免疫相关基因的表达检测30-42
• 2.2.6 斑马鱼p204转基因载体的构建42-48
• 3. 实验结果48-58
• 3.1 p204-EGFP和EGFP-N1质粒扩增、线性化和纯化结果48
• 3.2 荧光观察和荧光率、胚胎致死率的统计48-50
• 3.3 先天免疫相关基因实时定量检测结果50-53
• 3.3.1 各时期斑马鱼总RNA提取检测结果50-51
• 3.3.2 反转cDNA扩增目的条带结果51
• 3.3.3 实时定量PCR结果51-53
• 3.4 sting和tbk1基因原位杂交结果53-54
• 3.4.1 sting和tbk1探针的合成结果53
• 3.4.2 sting和tbk1原位杂交结果53-54
• 3.5 p204转基因载体tol2-p204的构建结果54-58
• 3.5.1 p204基因的扩增54-55
• 3.5.2 tol2-p204质粒线性化结果55-56
• 3.5.3 pCS-TP质粒线性化与体外合成mRNA56-57
• 3.5.4 tol2-p204与TP转座酶共注射后斑马鱼荧光观察57-58
• 4. 讨论58-63
• 4.1 斑马鱼作为模式生物研究TLR信号通路58-59
• 4.2 p204注射到斑马鱼胚胎中的表达与稳定性59-60
• 4.3 p204标记物对p204的影响60-61
• 4.4 斑马鱼实时定量和和原位杂交注意事项61-62
• 4.5 斑马鱼用于研究先天免疫信号通路的展望62-63
• 5. 结论63-64
• 参考文献64-72
• 致谢72-73
• 攻读学位期间发表的学术论文73-74
• 附件74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 何新,刘桂生,陈清轩,魏庆信,陈永福;转基因猪外源基因染色体定位的研究[J];动物学报;1998年02期

2 孟立;张艳丽;范钦龙;黄荣;王子玉;王锋;;转座子Tol2的特性及其在转基因动物中的应用[J];江西农业学报;2009年11期

3 邹钧;谢岳峰;刘东;朱作言;;外源基因在鲫鱼胚胎发育过程中的表达[J];水生生物学报;1991年04期

4 吴波,朱作言;转基因动物整合位点的研究进展[J];遗传;2003年01期

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本文编号：349631