转录因子FOXM1的核酸适配体筛选与应用

发布时间：2017-05-08 19:12

  本文关键词：转录因子FOXM1的核酸适配体筛选与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人类FOXM1蛋白属于Forkhead Box（Fox）转录因子家族，到目前为止这个家族在人类基因组中拥有至少50个成员，分别参与调节了细胞的分化、增殖、代谢与凋亡等生理过程，同时还对肿瘤发生和发展具有重要意义。FOXM1是一个与细胞增殖相关的转录因子，它被发现在人类的多种肿瘤细胞中都存在较高的表达水平，表明FOXM1与多种癌症的发生密切相关，如肝癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等。因此，对FOXM1的深入研究将有助于进一步揭示肿瘤发生的发病机理，并为抗肿瘤药物的研发提供可能的新靶点。 针对蛋白功能研究，目前传统方法多采用抗体免疫手段。近年来核酸适配体在生物分析、疾病诊断、治疗、药物筛选等方面的应用引起了人们极大的兴趣，以核酸适配体取代抗体利用ELISA和流式细胞技术检测蛋白质的表达，可以比使用抗体获得更高的灵敏度。同时核酸适配体可以通过核酸化学方法进行制备，经过相应的修饰及生物功能化，能够达到对生物大分子、细胞等生物靶标的选择性检测、定位和其生物功能的调控。由于具有以上特点，核酸适配体在生物医学基础研究和临床诊断与治疗方面显示出巨大的应用前景。 本文以重组的GST-FOXM1融合蛋白作为靶蛋白，GST蛋白作为反筛蛋白，以包含有77个碱基的随机单链DNA寡核酸库作为初始库，经过7轮筛选，获得了1条与靶蛋白FOXM1高特异性与高亲和力结合的单链DNA核酸适配体JX42，该适配体与FOXM1的解离常数Kd达到225nM。进一步研究发现核酸适配体JX42在复杂体系中也可以特异性地识别FOXM1。因此利用该核酸适配体能够高特异性、高亲和性地结合FOXM1蛋白的这一特点，把此核酸适体发展为研究FOXM1的有力工具，并且可以发展成为一种用于研究与FOXM1相关的人类恶性肿瘤及其他疾病的靶向探针。
【关键词】：核酸适配体 FOXM1 SELEX 特异性识别
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第1章 绪论9-23
• 1.1 核酸适配体简介9
• 1.2 SELEX 技术及其基本原理9-11
• 1.3 核酸适配体的筛选方法11-15
• 1.3.1 基于毛细管电泳的 SELEX(CE-SELEX)12
• 1.3.2 硝酸纤维素膜作为分离介质的筛选12
• 1.3.3 基于亲和色谱和磁珠的筛选12-13
• 1.3.4 基于 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)的体外筛选13-14
• 1.3.5 基于微流控芯片的筛选14-15
• 1.4 核酸适配体的特征以及在生物医学领域的应用15-20
• 1.4.1 核酸适配体的特征15-16
• 1.4.2 核酸适配体在生物医学领域的应用16-20
• 1.5 转录因子 FOXM1 概述20-21
• 1.6 本论文拟开展的研究工作21-23
• 第2章 GST-FOXM1 DBD 融合蛋白及 GST 蛋白的原核表达与纯化23-34
• 2.1 前言23-24
• 2.2 实验仪器与材料24-26
• 2.3 实验方法26-31
• 2.3.1 pGEX-4T-1-FOXM1(220-355 aa)重组质粒的鉴定26-28
• 2.3.2 GST-FOXM1DBD 融合蛋白与 GST 蛋白的表达、提取与纯化28-31
• 2.4 实验结果与讨论31-33
• 2.4.1 重组质粒 pGEX-4T-1- FOXM1(220-355 aa)的鉴定和转化31-32
• 2.4.2 GST-FOXM1DBD 融合蛋白与 GST 蛋白的表达、提取与纯化32-33
• 2.5 本章小结33-34
• 第3章 转录因子 FOXM1 DBD 核酸适配体的筛选34-43
• 3.1 前言34-35
• 3.2 实验仪器和材料35-36
• 3.3 实验方法36-39
• 3.3.1 FOXM1 DBD 蛋白核酸适配体的筛选36-38
• 3.3.2 荧光显微镜法检测库的富集情况38
• 3.3.3 连接、转化、克隆和测序38-39
• 3.4 结果与讨论39-42
• 3.4.1 筛选过程最佳循环数的确定39-40
• 3.4.2 富集情况的检测40-41
• 3.4.3 克隆与测序结果41-42
• 3.5 本章小结42-43
• 第4章 核酸适配体 JX42 对转录因子 FOXM1 识别的初步研究43-52
• 4.1 前言43-44
• 4.2 实验仪器和材料44
• 4.3 实验方法44-48
• 4.3.1 适配体 JX42 与 FOXM1-DBD 结合亲和力的考察44-46
• 4.3.2 适配体 JX42 与 FOXM1 结合特异性的考察46
• 4.3.3 231 细胞“免疫”荧光染色46-48
• 4.4 结果与讨论48-50
• 4.4.1 适配体 JX42 与 GST-FOXM1-DBD 的解离平衡常数值的测定48
• 4.4.2 适配体 JX42 与纯蛋白 GST-FOXM1-DBD 结合亲和力和特异性检测48-49
• 4.4.3 适配体 JX42 与细胞裂解物中 FOXM1 结合的亲和力和特异性的检测49
• 4.4.4 231 细胞“免疫”荧光染色49-50
• 4.5 本章小结50-52
• 结论与展望52-54
• 参考文献54-60
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文60-61
• 致谢61

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 唐岚;石巍;;FOXM1与胃癌关系的研究进展[J];社区医学杂志;2010年05期

2 陈国庆;姚珍薇;秦兴发;;靶向人转录因子FOXM1基因的shRNA慢病毒载体的构建与鉴定[J];中国生物制品学杂志;2011年09期

3 毓勤;;FK506和环孢素A阻断T细胞转录因子的核联系[J];国外医学情报;1992年07期

4 王金泉,刘志红;糖皮质激素免疫抑制作用机理的新认识[J];肾脏病与透析肾移植杂志;1997年02期

5 田文洪,汪明春,李杨秋,杨力健;RT-PCR检测血液病中GATA-3基因表达[J];临床血液学杂志;1998年02期

6 陈伟;一种新的转录因子——EPAS1[J];生理科学进展;2000年04期

7 李扬秋,杨力建,陈少华,卢育洪,张洹;急性非淋巴细胞白血病中转录因子GATA-2基因插入突变[J];中国实验血液学杂志;2000年04期

8 李晓青,曾水清,徐莉莉,程扬;血清诱导人视网膜色素上皮细胞中转录因子E2F1的表达及活化[J];中华眼底病杂志;2002年03期

9 陈萍,常才;先天性心脏病相关转录因子Csx/Nkx2.5基因的研究[J];国外医学.妇产科学分册;2004年03期

10 李武修;孙岩;;Forkhead转录因子超家族成员——FOXL2[J];口腔医学研究;2006年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 梁好均;刘伟;;核酸适配体链构象转变的研究[A];2011年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C];2011年

2 邹如杏;娄新徽;;基于三段式适配体探针的可卡因的检测[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

3 汪海林;章大鹏;;单核苷水平核酸适配体与蛋白质相互作用分析[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

4 薛利云;周小明;邢达;;基于核酸适配体探针和酶辅助荧光信号扩增的等温高灵敏度蛋白检测方法[A];中国光学学会2011年学术大会摘要集[C];2011年

5 谭蔚泓;;核酸适配体在肿瘤分子分型中的应用[A];中国化学会第28届学术年会第3分会场摘要集[C];2012年

6 高峰;夏瑞强;熊爱生;肖宁;洪义欢;姚泉洪;陈建民;;水稻AP2/EREBP类转录因子基因的功能研究[A];江苏省遗传学会植物分子育种学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

7 邸鹏;陈万生;张磊;;构建“转录因子-启动子”耦联载体开展植物生物碱次生代谢工程[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编（1933-2008）[C];2008年

8 吴艳;徐岚;周迎会;吴士良;;人类β1，3半乳糖基转移酶7(UDP-Gal：betaGlcNAc beta 1，3-galactosyltransferase polypeptide 7)催化功能的研究以及该基因表达与转录因子ets-1的相关性的探索[A];2008年全国糖生物学学术会议论文摘要[C];2008年

9 吴艳;徐岚;吴士良;;人类β3GalT7/GNT8 (UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1，3-galactosyltransferase polypeptide 7)催化功能的研究以及该基因表达与转录因子ets-1的相关性的探索[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

10 李肖霞;宋一萌;朱振久;付成来;李承红;朱毅;;转录因子KLFs在血管内皮祖细胞增殖分化中的作用[A];第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 潘文;核酸适配体在医药领域应用前景广阔[N];中国医药报;2010年

2 王小龙;科学家提高了多功能干细胞安全性[N];科技日报;2009年

3 白毅;UXT蛋白可增强转录因子NF—κB活性[N];中国医药报;2007年

4 香港麦迪信医学出版有限公司 供稿;凋亡与肿瘤：一对矛盾的连体婴[N];医药经济报;2002年

5 陈勇;专家有突破　借助基因杀死癌细胞[N];人民日报;2005年

6 本报记者 冯卫东;向左分裂向右分化[N];科技日报;2009年

7 记者 陈勇;美专家绘出大脑关键区域基因“分布图”[N];新华每日电讯;2004年

8 记者胡德荣;我国科学家培育出猪“万能”干细胞[N];健康报;2009年

9 胡德荣;我国揭示NF—κB细胞核内调控新机制[N];中国医药报;2007年

10 记者 顾钢;科学家发现干细胞蛋白质调控新机制[N];科技日报;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 申睿;基于功能寡核苷酸分子的蛋白质检测新方法研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

2 谢仲秋;转录因子Foxm1维持干细胞多能性的研究[D];湖南大学;2012年

3 胡燕;MUC1核酸适配体的筛选及其在肿瘤靶向治疗方面的初步应用研究[D];北京协和医学院;2012年

4 杨潮;转录因子FOXM1在肿瘤细胞上皮间质转化过程中的功能研究[D];湖南大学;2013年

5 莫萍;炎症因子TNF-α作用于转录因子FoxM1促进肝癌细胞增殖的机制研究[D];第四军医大学;2012年

6 何婧琳;基于构象转换和聚合酶反应的核酸适配体传感分析方法及应用研究[D];湖南大学;2010年

7 周桂萍;DNA杂交信号的介质调控和酶法放大研究[D];山东大学;2010年

8 王宇;FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中的表达及相关功能研究[D];第四军医大学;2013年

9 曾季平;新型有丝分裂转录因子FoxM1和组蛋白去甲基化酶RBP2在胃癌发生中的作用及相关分子机制[D];山东大学;2009年

10 刘俊;脂肪细胞特异性核酸适配体的筛选、分子识别及应用初探[D];中南大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 江霞;转录因子FOXM1的核酸适配体筛选与应用[D];湖南大学;2013年

2 谢洪朋;FoxM1核酸探针的构建及应用[D];湖南大学;2013年

3 王晓芳;基于核酸适配体的凝血酶检测新方法研究[D];山西大学;2012年

4 魏志鹏;新型电化学核酸适配体生物传感器的研究[D];华东交通大学;2012年

5 周亚文;核酸适配体在蛋白质检测及药物分析中的应用研究[D];西南大学;2012年

6 汤进录;基于核酸适配体和量子点的急性淋巴白血病细胞检测研究[D];湖南大学;2013年

7 彭倩雯;基于核酸适配体化学发光生物传感技术的研究[D];复旦大学;2011年

8 王文凤;真菌毒素寡核苷酸适配体的筛选与应用[D];江南大学;2012年

9 赵瑞芳;基于表面等离子体共振的适配体传感器研究[D];山西大学;2013年

10 李艳芬;电化学核酸适配体传感器[D];南京师范大学;2011年

  本文关键词：转录因子FOXM1的核酸适配体筛选与应用，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：351709