人脐带间充质干细胞向汗腺细胞诱导分化及向裸鼠移植的研究

发布时间：2017-05-09 08:11

  本文关键词：人脐带间充质干细胞向汗腺细胞诱导分化及向裸鼠移植的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)具有向多种成熟细胞分化的潜能，如成软骨细胞、成骨细胞、神经细胞及成脂肪细胞等，其分离、培养较为容易，纯度高，且来源丰富，可在体外多次扩增，异体移植免疫排斥风险小。由于UC-MSCs具有以上的优点，使其逐渐被研究者所关注，尤其是在组织的修复方面，可以将其应用于器官、组织的修复及重建。本实验通过研究人脐带间充质干细胞分离，在不同条件下的培养及鉴定，得出培养人脐带间充质干细胞的最优培养条件。并进一步通过间接共培养的诱导方式使其向汗腺细胞定向诱导分化，将诱导后的UC-MSCs用BrdU进行标定，移植入裸鼠皮肤，观察其在裸鼠体内的存活及分布状况。 方法： 1UC-MSCs的分离、培养和鉴定：获得无菌足月剖宫产健康胎儿脐带，剪刀将其剪成3-4cm长短的脐带组织段，，生理盐水反复冲洗，去除残留的血液，剪刀将其剪开后镊子剔除脐带中的两条脐动脉、一条脐静脉，以免被血管内皮细胞所污染。用镊子将脐带中的沃顿胶组织(Wharton’sJelly)呈条索状撕裂下来，剪刀剪成大小约1mm3的沃顿胶组织块，置于培养瓶中培养。当细胞长满瓶底后，0.25%胰酶消化贴壁细胞，进行传代。流式细胞术检测培养细胞的表面抗原表达情况。 2UC-MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：用MTT比色法分别检测不同胎牛血清浓度在490nm处吸光度值的均数(OD值)。同样用MTT比色法分别检测当种植密度不同时在490nm处吸光度值的均数(OD值)。观察传代后不同时期UC-MSCs的生长情况，绘制生长曲线。 3汗腺细胞(h-SGCs)培养：将所取正常全层皮肤，去除皮下脂肪后，剪成1mm3大小组织块，用Ⅱ型胶原酶消化法获得汗腺组织，培养汗腺细胞(h-SGCs)贴壁生长；大部分汗腺团块贴壁后，进行换液，此后3-4天换液一次。对培养细胞进行免疫组化检测CEA和CK7表面抗原的表达情况。 4UC-MSCs诱导分化及鉴定：将培养的汗腺细胞进行47℃水浴造成体外热休克，通过传三代(p3)UC-MSCs间接共培养诱导UC-MSCs分化为有汗腺表型的干细胞，免疫组化法检测CEA和CK7表面抗原的表达情况。 5对诱导后干细胞进行核型分析：将诱导后细胞加入秋水仙素0.2mg/L一滴，低渗固定消化等处理，进行细胞染色体检测。 6BrdU转染及鉴定：在传3代(p3)UC-MSCs中加入BrdU抗原40μg/ml用来标记培养基，48h后，可见UC-MSCs生长良好，悬浮细胞少，铺片用免疫组化法检测转染情况。 7将诱导分化后的细胞进行裸鼠移植：将诱导分化后的UC-MSCs进行BrdU标定，与人脱细胞异体真皮共同覆盖在裸鼠缺损皮肤创面上，覆盖异体裸鼠皮片，打包固定。2周后将包与缝线拆除，1个月后取活检，进行HE及免疫组化检测。移植后连续观察实验鼠3个月。 结果： 1UC-MSCs分离、培养、鉴定：培养3-5d后,已有少量脐带组织块周围爬出成纤维样细胞。一周后，可见部分组织块周围爬出成纤维样细胞，给予换液。之后2-3天给予换液一次，传1、2代(p1、P2)的UC-MSCs呈长梭行，形态均一。培养至传八代细胞(P8)，UC-MSCs仍然存活，但生长缓慢，形态开始发生变化，折光性变得较差，部分细胞已开始脱壁凋亡。对分离培养的UC-MSCs进行流式细胞术检测，干细胞表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞为较纯化的MSCs。 2UC-MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：当胎牛血清浓度为10%时MTT比色法检测OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量较多。当种植密度为105/ml时MTT比色法检测OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量较多。绘制的细胞生长曲线包括滞留期、生长对数期、平台期。 3汗腺细胞(h-SGCs)培养：培养3天后，已有汗腺贴壁，镜下可见汗腺团块周围爬出不规则形细胞，呈集落状生长；培养7天后，大部分汗腺团块贴壁，给予换液；12天后，镜下可见汗腺团块周围爬满不规则细胞，呈铺路石样生长。 4UC-MSCs诱导分化及鉴定：将诱导分化后的细胞进行免疫组化检测细胞特异抗原，CEA和CK7包浆染色均为红棕色，为阳性。 5对诱导后干细胞进行核型分析：镜下随机观察30个细胞的染色体，计数染色体条数，结果染色体数均为46条，均未见染色体变异。 6BrdU转染及鉴定：免疫组化检测结果可见部分细胞核呈棕黄色。 7将诱导分化后的细胞进行裸鼠移植：HE染色可见脱细胞异体真皮中细胞均匀分布。免疫组化检测BrdU抗原表达情况，可见BrdU标定的诱导后干细胞均匀分布在人脱细胞异体真皮中。 结论： 本实验通过研究人脐带间充质干细胞分离，在不同条件下的培养、诱导及鉴定，得出培养人脐带间充质干细胞的最优培养条件。并进一步通过间接共培养的诱导方式使其向汗腺细胞分化，将诱导后的UC-MSCs用BrdU进行标定，移植入裸鼠皮肤，观察其在裸鼠体内的存活及分布状况，得到以下结论： 1流式细胞术检测培养细胞的表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞较纯，可以用于实验研究。 2实验中我们发现最适宜UC-MSCs生长的环境为含10%胎牛血清和90%DMEM(L)的培养液，最适宜UC-MSCs生长的种植密度为105/ml。UC-MSCs生长呈现先慢后快再慢的S型曲线，实验中我们可以发现P3以内的UC-MSCs形态稳定、适应性强、代谢旺盛，可用于后续实验研究。 3经鉴定，诱导后干细胞免疫组化检测CEA和CK7表面抗原均为阳性，提示诱导后干细胞已具备汗腺细胞表型。 4染色体检测结果显示，此间接共培养诱导方式对染色体核型无明显变化，为安全、可靠诱导方式。 5经检测，BrdU转染为成功的。 6动物实验证实：诱导分化后的人脐带间充质干细胞移植在裸鼠缺损皮肤上安全、有效。移植后连续观察实验鼠3个月，未发现有不良反应。
【关键词】：人脐带间充质干细胞(UC-MSCs) 汗腺细胞(h-SGCs) 诱导分化 间接共培养 染色体
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-21
• 结果21-23
• 附图23-32
• 附表32-33
• 讨论33-36
• 结论36
• 参考文献36-39
• 综述 干细胞实现汗腺再生的研究现状39-48
• 参考文献44-48
• 致谢48-49
• 个人简历49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：352162