基于肝损伤小鼠模型重构小鼠和人的肝脏

发布时间：2017-05-09 11:04

  本文关键词：基于肝损伤小鼠模型重构小鼠和人的肝脏，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,肝病相关的体内研究多基于在小鼠的肝脏开展。然而,小鼠肝脏与人的存在差异,致使基于小鼠肝脏获得的许多研究结果不能直接应用到人体,而人的体内研究受伦理和技术等方面的制约。肝脏人源化的嵌合体(人鼠嵌合肝)小鼠是在人肝脏发育和再生机制、人类肝脏相关疾病(肝炎、肝硬化和肝癌等)发病机制、肝炎病毒(HBV和HCV等)易感动物模型建立、药物代谢动力学等领域具有重要的应用价值,其也为在大动物(如小型猪)体内重构人肝脏提供理论依据和进行实践探索,并成为临床前研究由鼠到人之间的重要载体和桥梁。因此,制备高比率嵌合有人肝细胞的人-鼠嵌合肝对人类的肝病研究具有巨大而深远的意义。 早期是将人肝细胞异位移植进小鼠体内建立人鼠嵌合肝,现在随着科学技术的不断进步,人们开始将目光转向利用干细胞来实现人和鼠肝脏的嵌合。干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞,它是一种未充分分化,尚不成熟的细胞,具有再生各种组织器官和人体的潜在功能,医学界称为“万用细胞”。这就为干细胞在一定环境下发育成肝细胞提供了理论依据。同时也为在小鼠体内建立人鼠嵌合肝模型提供了可能。 截止到现在,国内外均有文献报道将干细胞通过核移植或宫内移植进正常动物体内,以实现多组织多器官的嵌合。但是,由于宿主体内的微环境中缺乏移植细胞生长的各种激素和生长因子,宿主细胞的增殖将优先于移植细胞,因此,各组织器官的嵌合率比较低。为了克服上述困难,得到高比率嵌合的个体,选用特定器官缺陷的动物模型作为受体环境是较为理想的选择。 富马酰乙酰乙酸盐水解酶(Fah)基因敲除小鼠缺乏Fah基因,酪氨酸分解代谢的最后一步受到阻碍,导致富马酰乙酰乙酸盐(FAA)和前体(MAA)底物的聚集,FAA与MAA对肝脏有毒性。利用此肝损伤小鼠模型作为受体动物,将人干细胞移植进该鼠的囊胚中,有望提高人干细胞在宿主体内的增殖优势,这对研发人肝细胞高比率嵌合的嵌合肝模型是至关重要的。 为实现灵敏的非损伤、实时和可视化体内示踪移植供体细胞及其在体内衍生的细胞,通过综合分析活体内生物发光[用荧光素酶(Luciferase, Luc)基因标记细胞等]成像和荧光[荧光报告基团(GFP和RFP等)]成像各自的特点和优势,为将生物发光成像和荧光成像的优点集为一身,我们将用双报告或三荧光报告基因标记供体移植细胞,已达到活体示踪的目的。 在研究中,我们首先利用小鼠诱导性多潜能干细胞(Mouse induced pluripotent stem cells, miPSCs)通过囊胚腔移植(Blastocyst transplantation)建立鼠/鼠嵌合肝动物模型,待方法和技术成熟后再利用人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells, hMSCs)通过囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝动物模型。 第一部分小鼠诱导性多潜能干细胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝动物模型 目的： 通过小鼠诱导性多潜能干细胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝动物模型,一方面可以观察干细胞在体内对受损肝脏的修复作用,另一方面为建立人/鼠嵌合肝模型提供理论和实践基础。 材料和方法： (1)慢病毒载体pEF1a-ZsGreen-Fluc鉴定,慢病毒生产与鉴定,慢病毒感染miPSCs;(2)检测病毒感染后的miPSCs(LG-miPSCs)是否仍然保持其干性；(3)鼠/鼠嵌合体动物的制作将携带有绿色荧光蛋白(ZsGreen)和荧光素酶(Flue)双报告基因的miPSCs移植进Fah(-/-)小鼠的囊胚中,然后将囊胚移植进假孕母鼠的子宫内,待其出生；(4)体式荧光显微镜检测待小鼠出生后3天在镜下观察是否可以看到绿色荧光,待小鼠成年后取材,取其肝脏、肾脏、心脏、脑、肺脏、脾脏等脏器在镜下观察是否可见绿色荧光；(5)小动物活体成像仪检测小鼠从出生到成年,不同时间点腹腔注射Flue底物,观察是否可见Fluc荧光；(6)PCR检测取成年后小鼠的肝脏、鼠尾、肺、脑、肾脏、心脏、脾脏、肠等组织,一部分用于提取基因组DNA[另一部分用于制备石蜡切片以用于HE染色和免疫荧光(Immunofluorescence)检测],并采用Fah引物PCR检测各器官中是否有移植细胞的嵌合；(7)HE染色观察嵌合体动物肝脏的组织结构以确定肝脏结构是否正常；(8)免疫荧光检测检测嵌合体小鼠肝脏中Fah基因的表达水平,及其白蛋白(Alb)、CK18、CK19、转铁蛋白(transferrin)的表达；(9) Western blot检测嵌合体小鼠肝脏中Fah基因表达。 结果： (1)慢病毒载体鉴定、感染miPSCs以及其干性的鉴定鉴定结果符合预期,感染miPSCs(LG-miPSCs)效率接近100%,LG-miPSCs仍保持其多向分化潜能； (2)妊娠结局先后将LG-miPSCs移植进160枚Fah(-/-)小鼠的囊胚中,接着种植到10只假孕母鼠的子宫内,有四窝仔鼠顺利出生,数量共38只,经过撤药处理后,最终有2只幸存鼠发育到成年； (3)体视荧光显微镜和小动物活体成像仪检测从出生到取材各个时间点均未检测到ZsGreen和Flue双报告基因的表达； (4)Fah或Luc基因的基因型鉴定采用PCR对潜在的嵌合鼠所取肝脏组织针对FAH或Luc基因行基因型鉴定,在嵌合肝中检测到野生型Fah基因和报告基因Flue的存在； (5)HE染色嵌合鼠肝脏组织结构与正常小鼠的结构基本一致,而撤药的和没撤药的Fah(-/-)小鼠肝脏组织结构紊乱无序； (6)免疫荧光检测嵌合体小鼠肝脏免疫荧光检测结果显示,大部分肝细胞表达Fah,两只嵌合体小鼠的嵌合肝中LG-miPSCs衍生的鼠肝细胞的嵌合率分别为84.69%和88.43%,同时Fah阳性的肝细胞(即LG-miPSCs衍生的鼠肝细胞)能够正常表达Alb、CK18、CK19和transferrin; (7) Western blot检测Fah基因表达两只嵌合体小鼠的嵌合肝均能正常表达Fah基因,而Fah(-/-)小鼠未检测到Fah基因表达。 结论： (1)成功获得LG-miPSCs衍生的鼠肝细胞高比率嵌合的鼠-鼠嵌合肝小鼠模型,这为进一步利用hMSCs通过囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝动物模型奠定了良好基础。 第二部分人骨髓间充质干细胞(hMSCs)囊胚腔移植建立人/鼠嵌合肝动物模型的前期工作 目的： 通过人骨髓间充质细胞(hMSCs)囊胚腔移植在小鼠受损肝脏上建立人／鼠嵌合肝动物模型,该模型一方面将为在生物活体内研究人干细胞生物学行为提供理想模型,另一方面也将为在体内研究人类肝脏发育和再生、肝脏疾病的发生发展和治疗以及药物代谢评价提供理想模型。 材料和方法： (1)慢病毒载体pCMV-RFP-Alb-fLuc-ZsGreen(简称为pCRAGL)鉴定,慢病毒生产与鉴定,慢病毒感染hMSCs; (2)病毒感染后hMSCs干性的鉴定； 结果： (1)慢病毒载体鉴定、感染hMSCs以及其干性的鉴定鉴定结果符合预期,感染hMSCs效率为95%以上,感染后hMSCs(简称为RLG-hMSCs)仍保持其多向分化潜能；
【关键词】：诱导性多潜能干细胞 小鼠 囊胚腔移植 胚胎微环境 鼠/鼠嵌合肝模型 人/鼠嵌合肝模型 人源化动物 干细胞 骨髓间质干细胞 人源化器官 人源化肝脏/嵌合肝脏 小动物活体成像仪 绿色荧光蛋白 红色荧光蛋白 萤火虫荧光素酶
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R575
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-20
• 第一部分 小鼠诱导性多潜能干细胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝动物模型20-44
• 第一章 携带Fluc和ZsGreen双报告基因miPSCs系的建立及其鉴定20-26
• 1. 材料和方法20-24
• 2. 结果24-26
• 3. 讨论26
• 第二章 LG-miPSCs移植进Fah(-/-)小鼠囊胚中制备鼠/鼠嵌合肝模型26-44
• 1. 材料和方法26-40
• 2. 结果40-42
• 3. 讨论42-44
• 第二部分 人骨髓间充质干细胞(hMSCs)囊胚腔移植建立人/鼠嵌合肝动物模型44-51
• 第一章 携带RFP-Fluc-ZsGreen三报告基因hMSCs细胞系的建立及其鉴定46-51
• 1. 材料和方法46-49
• 2. 结果49-50
• 3. 讨论50-51
• 第三部分 全文讨论51-54
• 参考文献54-57
• 附图57-66
• 缩略表66-67
• 致谢67-68

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本文编号：352349