Rab5a蛋白调控巨噬细胞中TLR3/TLR4信号转导通路的研究
发布时间：2021-12-01 23:31
TLRs是天然免疫应答中一类高度保守的模式识别受体。通过识别病原体相关的分子模式，TLRs活化后促进免疫细胞分泌促炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素，从而清除病原微生物的感染。Rab5a是Rabs家族的一个主要成员，定位于质膜、早期内体和网格蛋白覆盖的囊泡。它负责调控早期内体与胞吞泡融合，是早期胞吞途径的一个主要限速成分。有研究发现，Rab5a不但参与了细胞内物质运输和蛋白分选，还参与了信号转导。Rab5a如何调控TLRs信号转导尚未见报道。目的：研究Rab5a在巨噬细胞RAW264.7中对TLR3和TLR4信号转导途径的作用。方法：通过脂质体法将Rab5a及其突变体Rab5aN133I的真核表达载体转染到RAW264.7细胞中，G418选择性培养基进行筛选，建立稳定表达Rab5a和Rab5aN133I的细胞系。通过RT PCR和Realtime PCR和Western Blot方法鉴定稳定表达细胞系。MTT法分析其生长特性，LPS和polyI:C刺激巨噬细胞系不同时间，检测iNOS、TNF α和IL6的表达水平的变化。结果：转染Rab5a/Rab5aN133I细胞Rab5a mRNA水平显著高...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TLR3介导的细胞信号转导图
Rab5a 调节巨噬细胞中 TLR3/TLR4 信号转导通路的研究单核巨噬细胞表面的 CD14， CD14 可以富集 LPS 促使 TLR4 活化，细传递致使转录因子NF κB和AP 1等的活化，效应细胞合成表达更多的TNIL 6 和 IL 8[36]，炎症因子的增高引起了一系列病理生理变化。最近几年发硬化（artherosclerosis, AS）[37]的发生和发展与炎症和免疫反应息息相t[38]等通过研究动脉粥样硬化斑，发现 TLR4 的表达显著提高，并且证实 相互识别导致一系列与 AS 相关的细胞因子的合成与释放。研究发现一些或抑制 TLR4 的信号传导途径。例如：IL 1 通过下调 TLR4 的表达诱导小刺激产生低反应性。Dagvadorj[39]等的研究表明，IL 10 可减少 MyD88 的抑制 LPS 诱导的 TNF α 的转录。Bafica 等[40]的研究发现，一些内源性因馈调节 TLR4 信号通路。如：LPS 诱导产生的 IFN 促进了一种鸟苷三磷7/Irgml 的转录，LRG47/Irgml 可以负向调控 TLR4 信号通路，抑制炎性细度产生。一些负反馈调节信号蛋白在对 LPS 耐受的形成过程的调控作用控制 G 细菌的感染。(图 2)。
细胞计数后将稳定转染细胞系以 5×105/孔接种于 6 孔板，设 3 个复孔。细胞贴壁12h 后即可更换成不含胎牛血清的 DMEM 培养基。LPS/Poly I:C 刺激 0h、12h 和 24h，取上清，按照 ELISA 测定试剂盒说明书测定上清中细胞因子的含量，酶标仪 450nm测定吸光值。以 OD 值为纵坐标、标准物的浓度为横坐标绘制标准曲线。根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。3 结果分析3.1 稳定表达 Rab5a 细胞系的鉴定筛选出稳定表达细胞系后，为了排除假阳性的可能，我们通过半定量的 RT PCR鉴定细胞系是否成功的稳定转染，如下图 3a 所示，转染 Rab5a 过表达质粒细胞和Rab5a 突变过表达质粒转染细胞的 Rab5a 表达量明显大于空质粒转染细胞。接着我们再次用 Real time PCR 验证也得到了同样的结果（图 3b）。以上结果说明稳定表达Rab5a 的细胞系已经成功建立。a b
【参考文献】：
期刊论文
[1]Toll样受体3介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制[J]. 资捷,王前,郑磊,熊石龙,王芳. 中国优生与遗传杂志. 2011(10)
[2]Rab蛋白在囊泡运输和信号传导中的作用[J]. 赵缜,樊绮诗. 生命的化学. 2009(05)
[3]Toll样受体信号传导在关节炎发病中的作用[J]. 奚正德,胡峻熊. 国际内科学杂志. 2009(06)
[4]Toll样受体4介导的革兰阴性细菌免疫应答研究进展[J]. 刘会领,陈敏,陈昌辉. 实用儿科临床杂志. 2008(10)
[5]Toll样受体4的研究及现状[J]. 赵保胜,霍海如,姜廷良. 中国临床药理学与治疗学. 2007(01)
[6]聚肌胞对小鼠前列腺癌的抑制作用[J]. 田原僮,潘玉琢,赵燕颖,范文静,赵丽娟,赵雪俭. 吉林大学学报(医学版). 2006(05)
[7]Toll样受体4与动脉粥样硬化[J]. 王虹艳,曲鹏. 心血管病学进展. 2005(S1)
[8]rab5a基因在肿瘤转移中的作用研究[J]. 史忠诚,于旸,李钰,傅松滨. 遗传. 2005(05)
[9]IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤快速杀伤效应的影响[J]. 方艳秋,宋燕,张慧杰,谭岩,刘立华,段秀梅,姜艳芳. 吉林大学学报(医学版). 2003(04)
[10]RAB5A蛋白的研究进展[J]. 宋春娇,史忠诚. 国外医学.遗传学分册. 2003(03)
本文编号：3527264
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TLR3介导的细胞信号转导图
Rab5a 调节巨噬细胞中 TLR3/TLR4 信号转导通路的研究单核巨噬细胞表面的 CD14， CD14 可以富集 LPS 促使 TLR4 活化，细传递致使转录因子NF κB和AP 1等的活化，效应细胞合成表达更多的TNIL 6 和 IL 8[36]，炎症因子的增高引起了一系列病理生理变化。最近几年发硬化（artherosclerosis, AS）[37]的发生和发展与炎症和免疫反应息息相t[38]等通过研究动脉粥样硬化斑，发现 TLR4 的表达显著提高，并且证实 相互识别导致一系列与 AS 相关的细胞因子的合成与释放。研究发现一些或抑制 TLR4 的信号传导途径。例如：IL 1 通过下调 TLR4 的表达诱导小刺激产生低反应性。Dagvadorj[39]等的研究表明，IL 10 可减少 MyD88 的抑制 LPS 诱导的 TNF α 的转录。Bafica 等[40]的研究发现，一些内源性因馈调节 TLR4 信号通路。如：LPS 诱导产生的 IFN 促进了一种鸟苷三磷7/Irgml 的转录，LRG47/Irgml 可以负向调控 TLR4 信号通路，抑制炎性细度产生。一些负反馈调节信号蛋白在对 LPS 耐受的形成过程的调控作用控制 G 细菌的感染。(图 2)。
细胞计数后将稳定转染细胞系以 5×105/孔接种于 6 孔板，设 3 个复孔。细胞贴壁12h 后即可更换成不含胎牛血清的 DMEM 培养基。LPS/Poly I:C 刺激 0h、12h 和 24h，取上清，按照 ELISA 测定试剂盒说明书测定上清中细胞因子的含量，酶标仪 450nm测定吸光值。以 OD 值为纵坐标、标准物的浓度为横坐标绘制标准曲线。根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。3 结果分析3.1 稳定表达 Rab5a 细胞系的鉴定筛选出稳定表达细胞系后，为了排除假阳性的可能，我们通过半定量的 RT PCR鉴定细胞系是否成功的稳定转染，如下图 3a 所示，转染 Rab5a 过表达质粒细胞和Rab5a 突变过表达质粒转染细胞的 Rab5a 表达量明显大于空质粒转染细胞。接着我们再次用 Real time PCR 验证也得到了同样的结果（图 3b）。以上结果说明稳定表达Rab5a 的细胞系已经成功建立。a b
【参考文献】：
期刊论文
[1]Toll样受体3介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制[J]. 资捷,王前,郑磊,熊石龙,王芳. 中国优生与遗传杂志. 2011(10)
[2]Rab蛋白在囊泡运输和信号传导中的作用[J]. 赵缜,樊绮诗. 生命的化学. 2009(05)
[3]Toll样受体信号传导在关节炎发病中的作用[J]. 奚正德,胡峻熊. 国际内科学杂志. 2009(06)
[4]Toll样受体4介导的革兰阴性细菌免疫应答研究进展[J]. 刘会领,陈敏,陈昌辉. 实用儿科临床杂志. 2008(10)
[5]Toll样受体4的研究及现状[J]. 赵保胜,霍海如,姜廷良. 中国临床药理学与治疗学. 2007(01)
[6]聚肌胞对小鼠前列腺癌的抑制作用[J]. 田原僮,潘玉琢,赵燕颖,范文静,赵丽娟,赵雪俭. 吉林大学学报(医学版). 2006(05)
[7]Toll样受体4与动脉粥样硬化[J]. 王虹艳,曲鹏. 心血管病学进展. 2005(S1)
[8]rab5a基因在肿瘤转移中的作用研究[J]. 史忠诚,于旸,李钰,傅松滨. 遗传. 2005(05)
[9]IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤快速杀伤效应的影响[J]. 方艳秋,宋燕,张慧杰,谭岩,刘立华,段秀梅,姜艳芳. 吉林大学学报(医学版). 2003(04)
[10]RAB5A蛋白的研究进展[J]. 宋春娇,史忠诚. 国外医学.遗传学分册. 2003(03)
本文编号：3527264
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