HBsAg与结核杆菌HSP70融合乙型肝炎DNA疫苗的基础研究

发布时间：2021-12-10 19:45

　　目的： 结核杆菌热休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）具有载体分子效应和 免疫佐剂的生物学功能，将结核杆菌HSP70基因与乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 基因融合，构建融合乙型肝炎DNA疫苗，并进一步研究融合乙肝DNA疫苗在小 鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫应答的效果，旨在通过基因融合技术提高乙肝 DNA疫苗的免疫效果，并为进一步探索乙肝治疗性疫苗和融合蛋白疫苗打基础。 方法： 1．HSP70真核表达质粒的构建和鉴定：用PCR的方法从结核杆菌标准株H₃₇Rv 基因组中扩增出HSP70基因，经A-T克隆入质粒pGEM-T vector，构建成重组 质粒pGEM-HSP70，经酶切鉴定和DNA序列测定证实目的基因无误后，亚克 隆到质粒pcDNA3.1（+），构建成真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70。 2．HBsAg及其与热休克蛋白70融合表达质粒的构建和鉴定：用PCR方法和基因 克隆技术，构建成重组质粒pCI-S（含HBsAg主蛋白基因全序列）、重组质粒 pCI-HSP70（含HSP70基因全...

【文章来源】： 重庆医科大学重庆市

【文章页数】：105 页

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符号说明
中文摘要
英文摘要
前言
    第一部分： 结核杆菌HSP70真核表达质粒的构建和鉴定
        实验材料
        实验方法
        实验结果
    第二部分： HBsAg及其与结核杆菌HSP70融合表达质粒的构建和鉴定
        实验材料
        实验方法
        实验结果
    第三部分： HBsAg及其与结核杆菌HSP70融合表达质粒在真核细胞中的表达
        实验材料
        实验方法
            1. 质粒的大量提取
            2. 质粒转染HepG2细胞（或COS-7细胞）
            3. HapG2细胞总RNA的提取
            4. RT-PCR检测目的基因在转录水平的表达
            5. 免疫细胞化学方法检测HBsAg的表达
            6. ELISA检测HBsAg的表达
        实验结果
            1. 目的基因在转录水平表达的RT-PCR检测结果
            2. 免疫细胞化学检测结果
            3. 重组质粒在HepG2细胞和COS-7细胞中的表达
    第四部分： HBsAg及其与结核杆菌HSP70融合表达质粒DNA免疫小鼠诱导其产生特异性免疫应答
        实验材料
        实验方法
            1. 质粒大量提取和定量
            2. 质粒DNA免疫小鼠
            3. 抗-HBs抗体检测方法
            4. 免疫小鼠脾细胞的制备
            5. 免疫小鼠脾细胞HBsAg特异性CTL的检测（LDH释放法）
            6. 免疫小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ、IL-4分泌的检测
        实验结果
            1. 质粒纯度和含量测定结果
            2. 免疫小鼠抗-HBs抗体反应检测结果
            3. 质粒DNA免疫小鼠HBsAg特异性CTL活性
            4. 质粒DNA免疫小鼠脾细胞体外诱导IL-2的分泌水平
            5. 质粒DNA免疫小鼠脾细胞体外诱导IFN-γ的分泌水平
            6. 质粒DNA免疫小鼠脾细胞体外诱导IL-4的分泌水平
讨论
参考文献
结论
本课题的创新点
文献综述1： 乙型肝炎核酸疫苗的研究进展
文献综述2： 分枝杆菌热休克蛋白的载体分子效应
致谢
攻读博士学位期间发表的学术论文及参加学术会议


【参考文献】：
期刊论文
[1]HBsAg真核表达重组质粒在EB病毒转化B淋巴母细胞中的表达 [J]. 梁增伟,李用国,兰英华,任红.  中华肝脏病杂志. 2001(05)
[2]HBV和HCV核酸疫苗的临床应用前景 [J]. 陈智.  中华肝脏病杂志. 2000(06)
[3]乙型肝炎病毒S基因单独和联合白细胞介素-12诱导小鼠产生特异性免疫应答 [J]. 赵鸿,成军,斯崇文.  中华传染病杂志. 2000(03)
[4]6种真核表达质粒作为HBV-DNA疫苗免疫小鼠的研究 [J]. 叶珈,任红,古柏燕,陶小红.  中华微生物学和免疫学杂志. 2000(04)
[5]慢性乙型肝炎治疗的新突破 [J]. 姚光弼.  肝脏. 1999(04)
[6]HBsAg在不同真核表达载体中的表达 [J]. 古柏燕,任红.  中华肝脏病杂志. 1999(02)
[7]细胞因子对乙肝病毒基因疫苗诱导产生抗体的影响 [J]. 张彤,张光磊,阮丽荣,张绍祖.  中华微生物学和免疫学杂志. 1997(06)



本文编号：3533277