人ADAM17启动子荧光素酶报告质粒的构建与鉴定

发布时间：2021-12-22 16:16

　　目的构建人去整合素-金属蛋白酶17（ADAM17）启动子的荧光素酶报告质粒,对不同位点进行定点突变,分析其转录活性。方法通过生物信息学分析ADAM17启动子区域的叉头转录因子M1（FoxM1）结合位点,以人胃癌细胞系MGC-803基因组为模板,PCR扩增ADAM17基因启动子-1 365～+51片段,连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中;对FoxM1结合的3个位点进行定点突变;转染至293T细胞后用双荧光素酶报告系统分析其转录活性。结果测序结果显示,ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体均构建成功;与pGL3-basic组相比,pGL3-ADAM17（-1 365～+51）组介导的荧光素酶活性明显升高（P<0.05）;与对照组相比,过表达FoxM1组介导的荧光素酶活性明显升高（P<0.05）,且pGL3-ADAM17（-1 365～+51）组高于突变组（P<0.05）。结论成功构建了人ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体,初步验证了ADAM17受转录因子FoxM1的转录调控。 

【文章来源】：基础医学与临床. 2019,39(09)CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

FoxM1结合及突变位点Fig2FoxM1bindingandmutationsites

基础医学与临床Basic＆ClinicalMedicine2019.39(9)图2FoxM1结合及突变位点Fig2FoxM1bindingandmutationsites图3pGL3-ADAM17(－1365～+51)突变质粒测序部分结果Fig3SectionalsequencingresultofmutantpGL3-ADAM17(－1365－－+51)置3flagvector为对照组，双荧光素酶报告系统结果显示，实验组荧光素酶活性均高于对照组，分别为16.925±0.011、4.925±0.024，14.251±0.052、4.846±0.055，10.183±0.023、3.162±0.027，8.219±0.018、2.416±0.015，且pGL3-ADAM17(－1365～+51)组活性高于突变组(图4)(P＜0.05)。3讨论去整合素-金属蛋白酶(adisintegrinandmetallo-proteinase，ADAMs)是一类锌依赖性跨膜糖蛋白，参与了机体的多种生物学过程［9］。ADAM17在人类多种肿瘤中异常高表达［2-4］。它的去整合素区可与整合素相互作用，影响细胞黏附和迁移;金属蛋白酶区可水解细胞外基质中大部分蛋白，为肿瘤转移扫除障碍;ADAM17还可以水解多种配体和受体，激活EGFＲ，作用于PI3K/AKT和Ｒas/Ｒaf/MAPK等多种*P＜0.05comparedwith3flagvectorgroup;#P＜0.05comparedwithpGL3-ADAM17(－1365～+51)group图4FoxM1对不同质粒转染293T细胞后相对荧光素酶活性的影响Fig4EffectofFoxM1ondoubleluciferaseactivityofdifferentplasmids8031

基础医学与临床Basic＆ClinicalMedicine2019.39(9)图2FoxM1结合及突变位点Fig2FoxM1bindingandmutationsites图3pGL3-ADAM17(－1365～+51)突变质粒测序部分结果Fig3SectionalsequencingresultofmutantpGL3-ADAM17(－1365－－+51)置3flagvector为对照组，双荧光素酶报告系统结果显示，实验组荧光素酶活性均高于对照组，分别为16.925±0.011、4.925±0.024，14.251±0.052、4.846±0.055，10.183±0.023、3.162±0.027，8.219±0.018、2.416±0.015，且pGL3-ADAM17(－1365～+51)组活性高于突变组(图4)(P＜0.05)。3讨论去整合素-金属蛋白酶(adisintegrinandmetallo-proteinase，ADAMs)是一类锌依赖性跨膜糖蛋白，参与了机体的多种生物学过程［9］。ADAM17在人类多种肿瘤中异常高表达［2-4］。它的去整合素区可与整合素相互作用，影响细胞黏附和迁移;金属蛋白酶区可水解细胞外基质中大部分蛋白，为肿瘤转移扫除障碍;ADAM17还可以水解多种配体和受体，激活EGFＲ，作用于PI3K/AKT和Ｒas/Ｒaf/MAPK等多种*P＜0.05comparedwith3flagvectorgroup;#P＜0.05comparedwithpGL3-ADAM17(－1365～+51)group图4FoxM1对不同质粒转染293T细胞后相对荧光素酶活性的影响Fig4EffectofFoxM1ondoubleluciferaseactivityofdifferentplasmids8031

【参考文献】：
期刊论文
[1]小鼠巨噬细胞活化标志物IL-12/IL-10启动子荧光素酶报告基因模型的构建及鉴定[J]. 张帆,叶鹏,邓君健,冯静,沈秉正,宋金春.  武汉大学学报(医学版). 2017(03)
[2]IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建[J]. 朱建冬,梁庄严,王森,侯为烨,邓小红,陈章权.  生物技术. 2015(06)
[3]ADAM17在恶性肿瘤中的研究及其进展[J]. 刘爽,马荣.  现代生物医学进展. 2013(17)



本文编号：3546694