曲霉中钙信号系统调控应答唑类药物的研究

发布时间：2017-05-11 01:08

  本文关键词：曲霉中钙信号系统调控应答唑类药物的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：曲霉是自然界中分布极为广泛的丝状真菌。在医学界,随着高效广谱抗生素的广泛应用、抗肿瘤治疗的深入开展,器官移植和外科其他介入性治疗的不断应用,侵袭性曲霉感染的发生呈现上升趋势。而在各种曲霉感染的药物治疗方面,与日新月异、种类繁多的其他抗菌药相比,抗真菌药物研究进展缓慢。 目前治疗深度曲霉感染的临床一线药物主要是伊曲康唑(ITZ)和伏立康唑(VRC)。然而,已经发现越来越多的临床分离菌对唑类药物产生耐药性。目前国际上公认的真菌抗药性产生的可能机理和途径,有的真菌细胞会启动多药抗性蛋白PDR的表达并行使功能,将唑类药物(azole)作为底物泵出胞外；还有的真菌细胞会通过改变药靶——麦角固醇的合成,减少唑类药物毒害。除了以上两种传统的机制以外,现在越来越多的研究表明当真菌处在有唑类药物的环境中时,药物通过对细胞膜施压从而激活真菌细胞逆境响应途径。 之前的研究发现Ca2+作为细胞信使的基础,通过改变胞浆Ca2+与胞内钙库或胞外Ca2+之间的浓度梯度来影响各种生理活动,包括生长、发育、增殖、分泌、物质运输以及逆境响应等,而传递这种信号依靠钙离子通道或者钙离子的转运子、胞内钙离子受体以及下游靶蛋白组成的钙信号系统。于是本文深入探究了钙信号系统与曲霉药物应答的关系。 我们分别利用模式真菌构巢曲霉和烟曲霉作为研究材料,采用胞外钙离子信号阻断剂EGTA、及钙信号系统重要蛋白的缺失菌株背景条件下,测试曲霉对药物的敏感性。正如我们预测,钙离子螯合剂2mM EGTA分别和次抑菌浓度的ITZ (0.1μ g/ml)、VRC(0.12μg/ml)共给药可以明显抑制曲霉生长。用E-test法测得加入2mM EGTA后,ITZ对构巢曲霉的抑菌浓度从1.5μg/ml降低至0.75μg/ml。缺失钙信号系统的重要蛋白calcineurin (CnaA)或下游转录因子CrzA时,构巢曲霉对唑类药物超敏感,然而当缺失钙离子通道蛋白MidA、CchA时,构巢曲霉对唑类药物的敏感性降低。我们进一步探究Ca2+信号途径中各组分是如何影响曲霉对唑类药物的敏感性。我们用Rh123模拟药物作为药物外排泵底物,通过流式细胞仪测荧光亮度,发现调节Ca2+浓度(加入2mM EGTA),可以调节药物外排泵的活性,使得胞内荧光亮度增加1倍；通过HPLC的方法测定提取出的Ca2+信号途径中重要蛋白缺失菌株中的麦角固醇的含量。我们发现在敲除了钙信号系统的重要蛋白calcineurin (CnaA)时,其中的麦角固醇含量相对野生型降低至88.6%,而敲除了钙离子通道蛋白MidA、CchA时,其中的麦角固醇含量相对野生型增加了7%。进而我们以条件致病菌——烟曲霉作为材料,钙离子螯合剂5mM EGTA分别和次抑菌浓度的ITZ (0.7μg/ml)、VRC(0.72μg/ml)共给药可以明显抑制烟曲霉生长,说明Ca2+信号途径也调节了烟曲霉对唑类药物的敏感性。基于此,我们进一步利用大蜡螟做活体实验证明EGTA和唑类药物联用比唑类药物单用更好的治疗烟曲霉感染,可以延缓感染烟曲霉的大蜡螟的死亡速率。 综上所述,钙离子通过影响药物外排泵的活力,调节曲霉对唑类药物的敏感性；钙信号系统主要蛋白通过影响唑类药物药靶——麦角固醇的合成,调节曲霉对唑类药物的敏感性；将机制研究的成果应用于实践,治疗烟曲霉感染的大蜡螟时,钙离子螯合剂和唑类药物联合效果好于唑类药物单用。 本研究成果意义在于可以采用钙信号系统的阻断剂或抑制剂和目前抗真菌临床一线药物-唑类药联合使用来对付临床上出现的耐药菌株。因此,将为控制真菌的耐药性和改进现有的治疗策略提供新思路。
【关键词】：钙信号通路 唑类药物 药物外排泵 EGTA 构巢曲霉 麦角固醇合成 大蜡螟
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R379.6;R96
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 综述10-25
• 1 抗真菌药物及真菌药物耐受性概述10-13
• 1.1 真菌病现状概述10
• 1.2 抗真菌药物研究概述10-12
• 1.2.1 以细胞壁组分D-β-1,3-葡聚糖的生物合成作为设计靶点11
• 1.2.2 以细胞壁组分几丁质的生物合成作为设计靶点11
• 1.2.3 以细胞膜组分麦角固醇作为设计靶点11
• 1.2.4 以细胞膜组分麦角固醇合成途径作为设计靶点11
• 1.2.5 以致病菌DNA、RNA的合成作为设计靶点11-12
• 1.2.6 有潜力成为抗真菌药物的研究12
• 1.3 真菌耐药性研究概述12-13
• 2 钙信号通路13-20
• 2.1 钙离子14-15
• 2.2 钙离子通道蛋白MidA和CchA15-16
• 2.3 钙离子结合蛋白CAM16-17
• 2.4 CaM激酶CnaA17-19
• 2.5 CnaA调控的转录因子CrzA19-20
• 3 模式生物构巢曲霉ASPERGILLUS NIDULANS20-23
• 4 本课题的研究内容、思路及方法23-25
• 4.1 研究内容23
• 4.2 研究思路与研究方法23-25
• 第二章 参与调控真菌多药抗性(PLEIOTROPIC DRUG RESISTANCE,P D R)的分子结构的信息学及系统学分析25-31
• 1 方法25-26
• 1.1 构建多物种N-J树25-26
• 1.2 统计每两种物种PDR的同源性26
• 1.3 分析各物种PDR蛋白的结构26
• 2 结果26-29
• 2.1 进化分析各物种中PDR蛋白亲缘关系26-28
• 2.2 PDR蛋白结构分析28-29
• 3 讨论29-30
• 3.1 真菌的多药抗性29
• 3.2 真菌中ABC超家族的系统进化关系29-30
• 4 结语30-31
• 第三章 构巢曲霉钙信号系统主要元件参与药物应答的研究31-46
• 1 材料与方法31-36
• 1.1 菌种及培养条件31-32
• 1.2 主要试剂及来源32
• 1.3 所用药物32-33
• 1.4 主要仪器设备及来源33
• 1.5 方法33-36
• 1.5.1 固体琼脂稀释法测定菌株对于药物的敏感性33-34
• 1.5.2 肉汤稀释法测试菌株对于药物的敏感性34
• 1.5.3 E-test实验测试菌株对于药物的敏感性34
• 1.5.4 丝状真菌体外MIC测试(参考CLSI-M38-A2)34-35
• 1.5.5 A.nidulans基因组DNA的提取35
• 1.5.6 alcA(p)：：GFP-pmrA同源整合菌株的构建35
• 1.5.7 原生质体的制备与转化35-36
• 1.5.8 重组子(发生Gene Replacement的转化子)的初步筛选36
• 1.5.9 重组子的进一步PCR鉴定36
• 2 实验结果36-44
• 2.1 胞外钙离子影响构巢曲霉野生型菌株对唑类药物的敏感性36-40
• 2.1.1 固体培养条件下野生型菌株在胞外钙离子浓度变化后对唑类药物的敏感性36-38
• 2.1.2 液体培养条件下野生型菌株在胞外钙离子浓度变化后对唑类药物的敏感性38-39
• 2.1.3 E-test实验测定菌株对唑类药物的敏感性39
• 2.1.4 体外MIC实验测定菌株对唑类药物的敏感性39-40
• 2.2 钙信号系统重要蛋白调控构巢曲霉对唑类药物的敏感性40-44
• 2.2.1 钙信号系统核心蛋白突变株对唑类药物的敏感性40-41
• 2.2.2 钙信号系统中钙通道蛋白缺失菌株对唑类药物的敏感性41-42
• 2.2.5 钙信号系统下游靶蛋白突变株对唑类药物的敏感性42-44
• 3 讨论44-46
• 第四章 钙信号系统调节构巢曲霉对唑类药物敏感性的机制研究46-58
• 1 材料与方法47-51
• 1.1 菌种及培养条件47
• 1.2 试剂与仪器47-48
• 1.3 方法48-51
• 1.3.1 菌液制备与染料负载48
• 1.3.2 流式细胞仪测定胞内Rhodamine 123的积累量48
• 1.3.3 胞内钙离子浓度测定菌液制备与染料负载48
• 1.3.4 激光共聚焦测定细胞内钙离子浓度变化48
• 1.3.5 菌丝体麦角固醇的抽提48-49
• 1.3.6 实时荧光定量PCR测定构巢曲霉野生型在唑类药物刺激时钙信号系统主要蛋白及药物外排泵基因的表达量49-51
• 2 结果51-56
• 2.1 加入EGTA后,胞内Rhodamine 123的积累量51-52
• 2.2 EGTA的加入会引起胞内钙离子浓度的降低52-53
• 2.3 钙信号系统主要蛋白缺失菌株胞内Rhodamine 123的积累量53-54
• 2.4 韩信号系统主要蛋白在吨类药物刺激下基因表达量的变化54-55
• 2.5 钙信号系统主要蛋白缺失菌株细胞膜组分麦角固醇含量测定55-56
• 3 讨论56-58
• 第五章 钙信号系统调节烟曲霉对唑类药物的敏感性且EGTA和唑类药物联用模式在活体中可以发挥作用58-63
• 1 材料与方法58-59
• 1.1 菌种及培养条件58
• 1.2 主要试剂及来源58-59
• 1.3 主要仪器设备及来源59
• 1.4 方法59
• 1.4.1 固体平板稀释法测试烟曲霉对唑类药物的敏感性59
• 1.4.2 E-test实验测试烟曲霉对于药物的敏感性59
• 1.4.3 大蜡螟(Galleria mellonella)侵染实验59
• 2 结果59-62
• 2.1 在固体培养条件下测定烟曲霉对唑类药物的敏感性59-60
• 2.2 E-test实验测定菌株对唑类药物的敏感性60-61
• 2.3 大蜡螟(Galleria mellonella)侵染实验61-62
• 3 讨论62-63
• 第六章 结论63-65
• 致谢65-66
• 参考文献66-72

【共引文献】

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