RNF26调控细胞抗病毒信号转导的分子机制及过氧化物酶体相关抗病毒蛋白的筛选

发布时间：2022-02-26 18:47

　　天然免疫系统是宿主抵抗病原入侵的第一道防线,它对病毒等病原微生物的识别主要依赖宿主的模式识别受体（pattern-recognition receptor, PRR）。病毒核酸被模式识别受体识别后能引发一系列信号事件诱导Ⅰ型干扰素的产生。Ⅰ型干扰素在保护宿主的抗病毒天然免疫反应中发挥着极其重要的作用,同时也是诱发自身免疫疾病的元凶。近年来,对于病毒核酸诱导Ⅰ型干扰素的信号转导的研究取得了很大进展。其中,病毒RNA能被RIG-I样受体（RIG-I like receptor, RLR）家族成员RIG-I （retinoic acid inducible gene I）和MDA5（melanoma differentiation-associated gene5）识别,它们进一步招募下游接头蛋白VISA （virus-induced signaling adaptor）和MITA （mediator of IRF3activation）激活转录因子NF-κB （nuclear factor kappa B）和IRF3/IRF7（interferon regulatory factor3/7... 

【文章来源】：武汉大学湖北省211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：184 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 研究背景
    1.1 病毒诱导Ⅰ型干扰素表达的调控机制
        1.1.1 天然免疫概述
        1.1.2 宿主细胞对病毒的识别及Ⅰ型干扰素的诱导
        1.1.3 MITA在抗病毒天然免疫反应中的作用
        1.1.4 MITA和它的翻译后修饰
        1.1.5 RNF26概述
    1.2 细胞抗病毒天然免疫与亚细胞结构
        1.2.1 过氧化物酶体与抗病毒天然免疫信号转导
        1.2.2 过氧化物酶体的纯化
        1.2.3 蛋白质组学相对定量
2 RNF26调控病毒诱导Ⅰ型干扰素产生的分子机制
    2.1 立项依据
    2.2 实验材料
        2.2.1 细胞和刺激物
        2.2.2 载体及构建载体相关材料
        2.2.3 构建逆转录病毒细胞系相关材料
        2.2.4 免疫共沉淀实验和免疫印迹实验相关材料
        2.2.5 体外泛素化实验相关材料
        2.2.6 双荧光素酶报告基因实验相关材料
        2.2.7 实时荧光定量PCR相关材料
        2.2.8 激光共聚焦显微镜观察荧光实验相关材料
        2.2.9 亚细胞组分分离实验相关材料
    2.3 实验方法
        2.3.1 细胞培养
        2.3.2 细胞瞬时转染
        2.3.3 构建载体和提取质粒
        2.3.4 构建细胞系
        2.3.5 制备多克隆抗体和免疫前血清
        2.3.6 免疫共沉淀和免疫印迹实验
        2.3.7 泛素化实验
        2.3.8 双荧光素酶报告基因实验
        2.3.9 实时荧光定量PCR实验
        2.3.10 激光共聚焦显微镜观察荧光实验
        2.3.11 亚细胞器组分分离
    2.4 实验结果
        2.4.1 RNF26是MITA的E3泛素连接酶
        2.4.2 RNF26与MITA相互作用
        2.4.3 RNF26靶向MITA的K150位点发生多聚泛素化修饰
        2.4.4 RNF26催化MITA发生K11连接的多聚泛素化修饰
        2.4.5 RNF26防止MITA发生K48连接的多聚泛素化修饰和降解
        2.4.6 RNF26调节病毒诱导的Ⅰ型干扰素产生
        2.4.7 RNF26影响IRF3蛋白的稳定性
    2.5 小结与讨论
        2.5.1 实验结果小结
        2.5.2 讨论
3 过氧化物酶体相关抗病毒天然免疫蛋白的筛选
    3.1 立项依据
    3.2 实验材料
        3.2.1 细胞和刺激物
        3.2.2 亚细胞组分分离实验相关材料
        3.2.3 蛋白质定量、脱盐、双甲基化标记和质谱鉴定相关材料
        3.2.4 双荧光素酶报告基因实验相关材料
    3.3 实验方法
        3.3.1 细胞培养、瞬时转染、双荧光报告基因实验和免疫印迹实验
        3.3.2 差速离心法从培养的HepG2细胞中分离轻线粒体组分
        3.3.3 连续密度梯度超速离心法从轻线粒体组分中分离过氧化物酶体
        3.3.4 定量蛋白质组样品制备
        3.3.5 双甲基化标记
        3.3.6 SCX色谱分离
        3.3.7 质谱分析与数据处理
    3.4 实验结果
        3.4.1 过氧化物酶体的富集
        3.4.2 质谱鉴定结果和两次结果的相关性分析
        3.4.3 鉴定蛋白的分组
        3.4.4 候选蛋白的初步功能鉴定
        3.4.5 部分候选蛋白的后续功能鉴定
    3.5 小结与讨论
        3.5.1 实验结果小结
        3.5.2 讨论
4 论文创新点与展望
参考文献
附录
攻博期间发表的科研成果目录
致谢



本文编号：3644924