miRNAlet-7c在anisomycin诱导JurkatT细胞凋亡中的作用

发布时间：2017-05-15 13:08

  本文关键词：miRNAlet-7c在anisomycin诱导JurkatT细胞凋亡中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：有文献报道anisomycin在体外能诱导多种细胞凋亡，本研究组之前的研究证实anisomycin能抑制多种不同组织学类型肿瘤细胞的增殖和诱导Jurkat T细胞的凋亡，并证实JNK （c-jun N-terminal or stress-activated protein kinases）信号通路介导Jurkat T细胞凋亡。目前为止，JNK信号通路下游作用于何种凋亡相关分子及其受哪些miRNA调控从而介导细胞凋亡尚未见报道。显然，探明这一点具有重要的科学意义，将有助于揭示anisomycin诱导细胞凋亡的机制以及丰富现有细胞凋亡理论。 目的：初步探讨let-7c在anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡中的作用与可能机制。 方法：流式细胞术分析不同浓度anisomycin于6h和24h诱导Jurkat T细胞凋亡以及JNK通路特异性阻断剂SP600125和ERK（extracellular-signal regulated kinase）通路特异性阻断剂PD98059的逆转作用；选择40ng/ml anisomycin为有效剂量，Western Blot检测anisomycin对凋亡相关蛋白P-BCL-XL和P-Bim表达水平的影响，并用SP600125和PD98059进行干预；用报告基因array检测anisomycin处理后Jurkat T细胞凋亡相关转录因子的活性；EMSA（electrophoretic mobility shift assay）检测转录因子AP-1的DNA结合活性；利用miRNAarray从48种与细胞凋亡相关的miRNA中筛选anisomycin作用后差异表达的miRNA，再利用qPCR进行验证。选择差异表达稳定的let-7c进行功能鉴定，转染let-7c-mimic和let-7c-inhibitor及其突变体，与anisomycin处理组比较，通过qPCR检测其增减倍数，并利用流式细胞术及Western Blot分析其在细胞凋亡中的作用。 结果： anisomycin诱导的Jurkat T细胞凋亡呈现浓度依赖性，随着anisomycin浓度的升高，双染细胞数目明显升高，SP600125可明显逆转这种变化，PD98059却无此作用。与对照组相比，经40ng/ml的anisomycin处理后，磷酸化的Bim （P-Bim）和磷酸化的BCL-XL（P-BCL-XL）的蛋白表达量明显升高，SP600125可致这两种蛋白的表达量明显下调，PD98059却不能逆转此变化。转录因子AP-1、NF-κb及P53的活性随anisomycin浓度升高而增强，而转录因子HIF、STAT-1及STAT-3的活性却随着anisomycin浓度的升高而降低，，转录因子ISRE的变化无规律性。EMSA结果显示随着anisomycin浓度的提高，AP-1的DNA结合活性依次增强，可被SP600125所逆转，与报告基因array中检测AP-1的结果呈现一致性。在检测anisomycin诱导Jurkat T细胞的凋亡相关miRNA表达谱中，与对照组相比，16种miRNA表达上调，31种表达下调。选择7种表达差异明显的miRNAs，即let-7c、miR-26、 miR-133b、miR-144、miR-193a、miR-296和miR-337进行qPCR验证，发现let-7c与miR-133b表达差异稳定，并具有生物重复性。Let-7c-mimic和Let-7c-inhibitor的作用显示，Let-7c可上调Jurkat T细胞的凋亡，与P-BCL-XL及P-Bim蛋白的上调密切关联。结论：anisomycin能诱导Jurkat T细胞的let-7c、miR-26、 miR-144、miR-193a和miR-337上调，下调miR-296和miR-133b的表达；anisomycin可能通过let-7c调控P-BCL-XL和P-Bim的表达从而诱导Jurkat T细胞凋亡。
【关键词】：anisomycin let-7c BCL-XL miRNAs 细胞凋亡 Jurkat T
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363;Q255
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-17
• 1 miRNA 的特性和功能10-11
• 2 miRNA 在细胞凋亡中的作用11-13
• 3 anisomycin 的结构和功能13-14
• 4 anisomycin 诱导凋亡的可能机制14-15
• 5 研究思路与目的15-17
• 材料和方法17-33
• 1 主要试剂17-18
• 2 主要仪器18
• 3 主要溶液的配制18-21
• 4 细胞与培养21
• 4.1 细胞株21
• 4.2 细胞培养21
• 4.3 细胞传代21
• 5 流式细胞术检测细胞凋亡21-22
• 6 Western Blot22-23
• 6.1 细胞处理22
• 6.2 蛋白的提取与定量22
• 6.3 电泳22-23
• 6.4 转膜23
• 6.5 抗体结合及显色23
• 7 报告基因 array 检测凋亡相关转录因子的活性23-25
• 7.1 质粒转染及细胞处理23-24
• 7.2 RNA 的提取24
• 7.3 TF Reporter plate array24-25
• 8 EMSA 检测 AP-1 的 DNA 结合活性25-28
• 8.1 细胞处理25
• 8.2 核蛋白的提取25-26
• 8.3 EMSA 结合反应26
• 8.4 电泳26-27
• 8.5 转膜27
• 8.6 检测27-28
• 9 miRNA array 检测凋亡相关 miRNA 表达谱28-29
• 9.1 细胞处理28
• 9.2 Apoptosis-associated miRNA Plate Array28-29
• 10 qPCR 确定差异表达的 miRNA29-32
• 10.1 逆转录29-30
• 10.2 q PCR30-32
• 11 let-7c-mimic 和 let-7c-inhibitor 的应用32
• 11.1 细胞处理及转染32
• 12 流式细胞术分析 let-7c 在凋亡中的作用32
• 13 统计学分析32-33
• 结果33-43
• 1 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡33-34
• 2 anisomycin 上调 P-BCL-XL 和 P-Bim 蛋白的水平34-36
• 2.1 anisomycin 上调 P-BCL-XL 蛋白表达34-35
• 2.2 anisomycin 上调 P-Bim 蛋白表达35-36
• 3 anisomycin 对 Jurkat T 细胞转录因子活性的影响36-37
• 4 anisomycin 对 AP-1 表达的影响37-39
• 5 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞 miRNA 差异表达的筛选39-40
• 6 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡中差异表达的 miRNA 的确定40-41
• 7 let-7c-mimic 及其抑制剂对 Jurkat T 细胞内 let-7c 含量的影响41
• 8 let-7c 在 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡中的作用41-42
• 9 let-7c 上调 P-BCL-XL 和 P-Bim 的表达42-43
• 讨论43-49
• 1 BCL-XL 与 Bim 参与 anisomycin 诱导的 Jurkat T 细胞凋亡43-44
• 2 转录因子在 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡中的作用44-46
• 3 let-7c 诱导凋亡的可能机制46-49
• 小结49-50
• 参考文献50-54
• 发表论文54-55
• 致谢55-56
• 英文缩略词表56-57

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本文编号：367857