克里米亚—刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白的表达纯化、结晶、结构及功能分析

发布时间：2017-05-15 19:05

  本文关键词：克里米亚—刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白的表达纯化、结晶、结构及功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF)是一种致死率达30%-50%的蜱传播的传染病,在世界各地广泛流行,已经在非洲、欧洲、亚洲等的30多个国家和地区都有报道。1965年我国首位病例出现在新疆巴楚县,也称为新疆出血热,致死率高达80%,主要集中于我国的西南和西北地区。克里米亚-刚果出血热主要有两种感染途径：一是通过蜱类直接叮咬,二是通过皮肤伤口感染。临床症状一般为发热、头痛、呕吐、出血、肝肾衰竭等。目前没有有效的治疗手段。该病是由于感染克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)引起的,CCHFV是负链RNA病毒,属于布尼亚病毒科内罗病毒属,基因组RNA包括L、M、S三段,分别编码RNA聚合酶、糖蛋白和核蛋白(NP)。该病毒的传播性强,被认为有被恐怖分子利用的危险,CCHFV已被列为生物安全四级病原体(BSL-4)。迄今为止,针对CCHFV的基础研究还很缺乏。 CCHFV核蛋白(Nucleoprote in, NP)结合病毒的基因组RNA,形成核蛋白-RNA复合物(RNP),能参与病毒RNA复制、衣壳化及病毒粒子装配等重要过程。病毒的核蛋白还能与病毒蛋白及宿主细胞内蛋白发生相互作用来保护自身干扰细胞正常功能。 本论文以CCHFV NP为研究对象,对核蛋白进行表达、纯化、结晶等工作。我们首先将核蛋白的全长基因构建到原核表达载体,在大肠杆菌系统表达目的蛋白,进一步纯化,通过大量结晶条件的筛选获得该蛋白的晶体。利用X-ray衍射收集了2.3A的衍射数据,解析晶体结构。与其他报道的负链RNA病毒核蛋白结构不同,CCHFV NP的结构明显具有头部和杆部两个结构域,整体像“球拍”。在此基础上,对CCHFV NP进行了进一步的功能研究,包括CCHFV NP在体外的聚集状态、NP和RNA的结合强弱、NP和宿主细胞蛋白Caspse3的相互作用、特异的DNA核酸酶活性等诸多方面。 因此,针对CCHFV核蛋白进行的结构和功能方面的研究,不但可以为阐明病毒的复制转录机制提供直接可靠的结构基础,而且可以为这一传染病的防控与治疗提供可靠的靶点。
【关键词】：克里米亚-刚果出血热病毒 核蛋白 蛋白三维结构
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.32
【目录】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 目录9-12
• 符号说明12-13
• 第一章 克里米亚-刚果出血热病毒的核蛋白研究背景13-28
• 第一节 克里米亚-刚果出血热病毒的研究现状13-17
• 1.1.1 克里米亚-刚果出血热简介13-14
• 1.1.2 克里米亚-刚果出血热病毒概况14-16
• 1.1.3 克里米亚-刚果出血热病毒的检测16
• 1.1.4 克里米亚-刚果出血热的治疗和控制16-17
• 第二节 布尼亚病毒科研究概况17-20
• 1.2.1 布尼亚病毒科的成员17
• 1.2.2 布尼亚病毒的结构及基因结构特征17-19
• 1.2.3 布尼亚病毒科病毒的生活周期19-20
• 1.2.4 布尼亚病毒科引发的疾病20
• 第三节 核蛋白的研究进展20-28
• 1.3.1 核蛋白在病毒生活周期中的作用20-21
• 1.3.2 几种负链RNA病毒核蛋白的研究概况21-27
• 1.3.3 克里米亚-刚果出血热核蛋白的研究意义27-28
• 第二章 主要实验过程28-43
• 第一节 CCHFV NP的蛋白体外表达28-33
• 2.1.1 蛋白体外表达的原理28
• 2.1.2 实验材料28-29
• 2.1.3 实验方法29-33
• 第二节 CCHFV NP的蛋白纯化33-36
• 2.2.1 蛋白纯化的原则和方法33-35
• 2.2.2 实验材料35
• 2.2.3 实验方法35-36
• 第三节 CCHFV NP的结晶36-43
• 2.3.1 蛋白质结晶的原理和方法37-40
• 2.3.2 实验材料40-41
• 2.3.3 实验方法41-43
• 第三章 CCHFV NP三维结构的研究43-54
• 第一节 CCHFV NP表达、纯化和结晶的结果43-46
• 3.1.1 CCHFV NP的表达结果43-44
• 3.1.2 CCHFV NP的纯化结果44-45
• 3.1.3 CCHFV NP的结晶结果45-46
• 第二节 硒代甲硫氨酸CCHFV NP晶体的获得46-50
• 3.2.1 硒代甲硫氨酸的原理46
• 3.2.2 实验试剂配方及处理46-48
• 3.2.3 实验过程48
• 3.2.4 硒代CCHFV NP纯化和结晶结果48-50
• 第三节 数据收集和结构解析50-54
• 3.3.1 X射线衍射的原理50-51
• 3.3.2 数据收集和结构解析51-52
• 3.3.3 CCHFV NP的三维结构52-54
• 第四章 CCHFV NP的功能研究54-67
• 第一节 CCHFV NP的体外聚合状态54-55
• 第二节 CCHFV NP与mRNA帽子的结合能力的分析55-57
• 4.2.1 通过等温量热滴定实验测定CCHFV NP与mRNA帽子类似物的结合55-57
• 4.2.2 晶体浸泡探索CCHFV NP与mRNA帽子的结合能力57
• 第三节 探究CCHFV NP与RNA的结合57-60
• 4.3.1 核酸酶对CCHFV NP结合天然核酸的能力的影响57-59
• 4.3.2 利用EMSA分析CCHFV NP与RNA的结合能力59-60
• 第四节 CCHFV NP与Caspase3的相互作用60-61
• 第五节 CCHFV NP特异的DNA核酸内切酶活性61-67
• 4.5.1 CCHFV NP的核酸酶活性具有金属依赖性62
• 4.5.2 CCHFV NP具有特异的DNA核酸酶活性62-63
• 4.5.3 CCHFV NP具有特异的DNA核酸内切酶活性63-65
• 4.5.4 CCHFV NP核酸酶酶活性位点的确定65-67
• 第五章 全文总结67-68
• 参考文献68-71
• 致谢71-72
• 附录72-73
• 个人简历73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 曹蕾;唐青;陶晓燕;黄莹;杜加亮;张守峰;扈荣良;;狂犬病病毒N基因的杆状病毒表达及鉴定[J];病毒学报;2010年05期

2 唐青;;克里米亚-刚果出血热研究状况与进展[J];中华实验和临床病毒学杂志;2006年01期

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4 相大鹏;师永霞;李小波;;新疆出血热的研究进展[J];中国医药生物技术;2009年01期

5 王树成,米保国,曹燮政;克里米亚 - 刚果出血热[J];中国兽医杂志;1998年03期

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本文编号：368588