CD38对B细胞发育的影响及其机制

发布时间：2017-05-16 13:24

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【摘要】：目的: CD38在心血管疾病、肿瘤及代谢性疾病中有着广泛的调节作用；但其在免疫系统中的作用少见报道。我们的前期研究发现TLR4mut小鼠B细胞发育障碍，且CD38-/-小鼠脾脏中TLR4的表达显著下降。本研究旨在阐明CD38缺陷对TLR4分布及表达的影响，揭示CD38缺陷对B细胞发育的影响及其节点，探索CD38在抗炎症反应中的潜在作用及其机制。这方面的研究将弥补我们对CD38在B细胞发育中作用认识的缺陷，为医学干预提供新的靶点。 方法: 1.通过小鼠尾巴DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）技术扩增CD38和Neo基因，鉴定小鼠是否成功敲除CD38基因； 2.通过逆转录-聚合酶链式反应（Reverse transcriotion-polymerase chainreaction, RT-PCR）检测WT和CD38-/-小鼠内脏器官(心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺及淋巴结)中TLR4的mRNA表达水平； 3.分别通过Real-time PCR和蛋白印迹技术检测WT和CD38-/-小鼠脾脏中TLR4的mRNA和蛋白表达水平，同时通过蛋白印迹技术检测Sirt1和NF-κB的蛋白表达水平； 4.通过Real-time PCR检测WT和CD38-/-小鼠脾脏中炎性因子(包括TNF-α，MCP-1，IL-1β和IL-6)的表达水平； 5.通过HE染色和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC-P)比较WT和CD38-/-小鼠脾脏的组织学差异； 6.通过磁珠分选法从WT和CD38-/-小鼠脾脏中进一步分选纯化出B细胞，然后通过Real-time PCR和蛋白印迹技术检测B细胞中TLR4的mRNA和蛋白表达，同时通过蛋白印迹技术检测Sirt1和NF-κB的蛋白表达水平； 7.通过Real-time PCR检测WT和CD38-/-小鼠B细胞中炎性因子(包括TNF-α，MCP-1，IL-1β和IL-6)的表达水平； 8.采用细胞计数法比较WT和CD38-/-小鼠脾脏总细胞和B细胞数量差异； 9.通过流式细胞分析技术和相应表面抗体染色检测B细胞的发育、细胞周期和细胞凋亡情况。 结果: 1.实验所用CD38基因敲除小鼠均为纯合子，保证了实验结果的可靠性； 2.主要脏器中脾脏TLR4的表达特异性下降，CD38敲除小鼠的TLR4表达水平呈2倍左右降低； 3. CD38敲除小鼠脾脏发育受限，其炎性因子TNF-α、MCP-1和IL-6表达显著下降，而IL-1β表达显著升高； 4. CD38敲除小鼠脾脏中NF-κB和Sirt1蛋白的表达水平显著升高； 5. CD38敲除小鼠脾脏中巨噬细胞数目减少； 6. CD38敲除小鼠的B细胞数量呈2倍下降，且其MCP-1的表达显著降低，，IL-1β的表达显著升高，变化趋势与脾脏一致，而TNF-α、IL-6的表达没有很明显的差异； 7. CD38敲除小鼠的B细胞中TLR4表达降低，而NF-κB和Sirt1基因的表达显著上升； 8. CD38敲除小鼠B细胞发育障碍，体现在成熟B细胞数目减少和T1-T2发育阻滞，但其细胞周期和凋亡不受影响；结论: CD38基因敲除一方面通过降低B细胞中TLR4基因的表达，引起MCP-1的表达下降；另一方面通过增强Sirt1基因的表达，去乙酰化NF-κB，抑制MCP-1的表达；二者可能共同抑制T1-T2的转型，从而影响B细胞的发育成熟。
【关键词】：CD38 B细胞 发育 炎性因子 Toll样受体4
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第1章 绪论12-20
• 1.1 CD38 与固有免疫12-17
• 1.1.1 CD38 简述12-13
• 1.1.2 固有免疫与 TLR 信号13-14
• 1.1.3 炎性因子与 B 细胞发育14-16
• 1.1.4 CD38 与固有免疫16
• 1.1.5 CD38 与炎性反应16-17
• 1.2 B 细胞发育相关因子17-19
• 1.2.1 Sirt1 与 CD3817-18
• 1.2.2 TLR/NF-ΚB 信号通路18-19
• 1.3 小结19-20
• 第2章 CD38 基因敲除对 TLR4 分布及表达的影响20-29
• 2.1 引言20
• 2.2 材料和方法20-26
• 2.2.1 小鼠 CD38 基因整体水平敲除的原理及其鉴定20-22
• 2.2.2 小鼠主要脏器中总 RNA 的提取22
• 2.2.3 RNA 浓度的测定22-23
• 2.2.4 RNA 逆转录成 cDNA23
• 2.2.5 PCR 扩增 TLR4 基因的 mRNA23-24
• 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳24
• 2.2.7 凝胶成像系统分析24
• 2.2.8 脾脏总蛋白的提取24
• 2.2.9 Western Blot 法检测脾脏中 TLR4 的蛋白表达水平24-26
• 2.3 实验结果26-28
• 2.3.1 CD38 基因敲除小鼠基因型鉴定26-27
• 2.3.2 CD38 基因敲除对 TLR4 基因在不同脏器中分布及表达的影响27-28
• 2.3.3 CD38 基因敲除对脾脏中 TLR4 基因表达的影响28
• 2.4 结论28-29
• 第3章 CD38 基因敲除对脾脏及其炎性因子的影响29-38
• 3.1 引言29
• 3.2 材料和方法29-34
• 3.2.1 Western Blot 检测脾脏中 TLR4、NF-κB 和 Sirt1 的蛋白表达水平29
• 3.2.2 荧光定量 PCR 检测脾脏中 TLR4 和细胞炎性因子的 mRNA 表达29-31
• 3.2.3 组织 HE 染色31-32
• 3.2.4 免疫组化32-34
• 3.3 实验结果34-37
• 3.3.1 CD38 基因敲除对小鼠脾脏大小及重量的影响34-35
• 3.3.2 CD38 基因敲除对小鼠脾脏中炎性因子表达水平的影响35
• 3.3.3 CD38 基因敲除对小鼠脾脏中 NF-κB 和 Sirt1 蛋白表达的影响35-36
• 3.3.4 CD38 基因敲除对小鼠脾脏炎性细胞的影响36-37
• 3.4 结论37-38
• 第4章 CD38 基因敲除对 B 细胞发育的影响及其机制38-47
• 4.1 引言38
• 4.2 材料和方法38-40
• 4.2.1 B 细胞的分选38-39
• 4.2.2 B 细胞中 RNA 的提取39
• 4.2.3 荧光定量 PCR 检测 B 细胞中 TLR4 和炎性因子的 m RNA 表达水平39
• 4.2.4 B 细胞中 TLR4、NF-κB 和 Sirt1 基因的蛋白表达水平39
• 4.2.5 流式细胞仪检测 B 细胞的发育情况39-40
• 4.2.6 流式细胞仪检测 B 细胞的细胞周期40
• 4.2.7 流式细胞仪检测 B 细胞的凋亡40
• 4.3 实验结果40-46
• 4.3.1 CD38 基因敲除对小鼠脾脏总细胞和 B 细胞数量的影响40-41
• 4.3.2 CD38 基因敲除对小鼠脾脏 B 细胞中炎性因子表达的影响41-42
• 4.3.3 CD38 基因敲除对小鼠脾脏 B 细胞中 NF-κB 和 Sirt1 蛋白表达的影响42-43
• 4.3.4 CD38 基因敲除对小鼠脾脏 B 细胞发育的影响43-45
• 4.3.5 CD38 基因敲除对小鼠脾脏 B 细胞细胞周期和凋亡的影响45-46
• 4.4 结论46-47
• 第5章 讨论47-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-53
• 附录53-56
• 攻读学位期间研究业绩56-57
• 综述57-63
• 参考文献61-63

【共引文献】

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本文编号：370978