单纯疱疹病毒I型UL43基因体外表达及功能初步研究

发布时间：2017-05-16 20:27

  本文关键词：单纯疱疹病毒I型UL43基因体外表达及功能初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 体外构建HSV-1UL43真核表达载体，利用生物信息学分析结果，在体外对其表达的蛋白质的功能进行初步研究，为探究UL43编码蛋白质与药物作用的靶点打下基础。 方法： 1.利用生物信息学DNAStar软件，Protpara软件soPMA程序ESyPred3D程序http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/；http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html等网站或程序对HSV-1UL43遗传进化树和UL43p结构和功能进行预测和分析。 2.利用基因工程原理方法，构建HSV-1UL43用于体外表达的T克隆载体和真核表达载体。 3.构建HSV-1膜融合过程中必要的四种基本糖蛋白(gB，gD，gH-gL)T克隆载体以及真核表达载体。利用脂质体转染效应细胞，细胞免疫酶联分析，体外分析UL43p在细胞到细胞膜融合过程中的作用。 结果: 1. HSV-1UL43基因存在于α和γ类疱疹病毒中，并与猴类同源性较高，与同为人类疱疹病毒的HHV-3及HHV-8同源性较低。但结构显示Prv UL43同源性与HSV-1较高。 2. HSV-1UL43p中磷酸化位点较为丰富。UL43p跨膜结构综合预测为8跨膜，与PrvUL43p相类似。 3.体外构建的克隆载体和真核表达载体经测序后，其序列与实际情况相符。HSV-1UL43p分子量为34kDa。 4.细胞免疫酶联反应显示UL43p有抑制膜融合的作用，其效果呈剂量依赖性。 结论:作为单纯疱疹病毒编码的跨膜蛋白，HSV-1UL43p与HSV-1UL20p等非糖蛋白类似，在细胞到细胞膜融合过程中发挥着“刹车员”的作用：具有抑制膜融合的效果。
【关键词】：单纯疱疹病毒1型 跨膜蛋白 细胞到细胞膜融合 抑制现象
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 中文摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 目录6-9
• 主要英文缩略词表9-10
• 第一章 前言10-27
• 1.1 疱疹病毒感染性10-11
• 1.2 HSV-1UL43 基因11-15
• 1.3 生物信息学15-16
• 1.4 生物信息学的研究方向16-18
• 1.4.1 序列比对16-17
• 1.4.2 蛋白质的分析17-18
• 1.4.3 蛋白质功能性预测18
• 1.5 病毒侵入的方式18-21
• 1.6 疱疹病毒融合机制21-22
• 1.7 病毒诱导的膜融合和自我抑制现象22-24
• 1.8 无病毒细胞融合模型24-25
• 1.9 本研究目的、意义和内容25-27
• 第二章 HSV-1UL43 基因遗传信息学分析27-36
• 2.1 实验目的27
• 2.2 主要生物分析软件和网站27
• 2.3 实验方法27-28
• 2.3.1 HSV-1 UL43 基因以及其同源基因核苷酸序列遗传进化树分析27
• 2.3.2 HSV-1 UL43 基因以及其同源基因核苷酸序列多重比对27
• 2.3.3 HSV-1 和 Prv UL43p 基本特性分析27
• 2.3.4 HSV-1 UL43p 立体构象分析27-28
• 2.3.5 HSV-1 UL43p 和 Prv UL43p 疏水性分析28
• 2.3.6 HSV-1 UL43p 和 Prv UL43p 跨膜结构分析28
• 2.3.7 HSV-1 UL43p 和 Prv UL43p 磷酸化位点预测28
• 2.4 实验结果28-34
• 2.4.1 遗传进化树分析28-29
• 2.4.2 核苷酸及氨基酸同源比对29-30
• 2.4.3 蛋白质理化性质分析30-31
• 2.4.4 二级结构预测31
• 2.4.5 蛋白质立体结构预测31-32
• 2.4.6 蛋白质疏水性分析32
• 2.4.7 蛋白质跨膜结构预测和分析32-33
• 2.4.8 蛋白质磷酸化位点预测33-34
• 2.5 本章小结34-36
• 第三章 HSV-1UL43 基因载体构建以及体外表达36-45
• 3.1 实验目的36
• 3.2 主要实验材料及试剂36-38
• 3.2.1 实验材料36
• 3.2.2 主要试剂配制方法36-38
• 3.2.3 主要实验仪器38
• 3.3 实验方法38-42
• 3.3.1 病毒的扩增38
• 3.3.2 UL43 基因的克隆和测序38-39
• 3.3.3 PCR 产物的纯化和回收:39
• 3.3.4 目的片段与克隆载体体外重组39-40
• 3.3.5 感受态细胞的制备40
• 3.3.6 重组质粒转化40
• 3.3.7 克隆载体的鉴定40
• 3.3.8 质粒的鉴定与提取40-41
• 3.3.9 构建 HSV-1UL43 真核表达载体及鉴定表达后目的蛋白41-42
• 3.4 结果42-44
• 3.4.1 HSV-1UL43 基因的克隆和测序42-43
• 3.4.2 PCR 鉴定重组质粒43-44
• 3.4.3 HSV-1UL43 基因的表达44
• 3.5 本章小结44-45
• 第四章 HSV-1 UL43p 功能初步研究45-60
• 4.1 实验目的45
• 4.2 主要实验材料及试剂45-46
• 4.2.1 瞬时转染试剂与材料45
• 4.2.2 CELISA 试剂与材料45-46
• 4.2.3 细胞融合分析试剂与材料46
• 4.3 实验方法46-53
• 4.3.1 HSV-1 糖蛋白 gB, gD, gH, gL 克隆载体构建46-49
• 4.3.2 HSV-1 糖蛋白 gB, gD, gH, gL 真核表达质粒的构建49-50
• 4.3.3 Westemblot 鉴定分析50
• 4.3.4 脂质体转染 COS 细胞:50
• 4.3.5 瞬时转染方法50
• 4.3.6 细胞内和细胞表面表达总方法50-51
• 4.3.7 细胞融合分析方法51-52
• 4.3.8 注意事项52-53
• 4.4 结果53-59
• 4.4.1 HSV-1gB,gD,gH,gL 基因扩增及测序53-54
• 4.4.2 特异性抗体鉴定蛋白质的表达54-55
• 4.4.3 COS 细胞中 HSV-1 糖蛋白的表达55-56
• 4.4.4 无病毒细胞融合模型效果56-57
• 4.4.5 UL43p 在膜融合过程中的作用57-59
• 4.5 本章小结59-60
• 第五章 讨论60-65
• 第六章 结论和展望65-67
• 6.1 全文总结65
• 6.2 展望65-67
• 参考文献67-77
• 攻读硕士学位期间论文发表情况77-78
• 致谢78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张春霆;生物信息学的现状与展望[J];中国青年科技;2001年01期

  本文关键词：单纯疱疹病毒I型UL43基因体外表达及功能初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：371866