DJ-1稳定高表达对模拟缺血/再灌注所致H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用研究

发布时间：2022-12-23 18:41

　　目的： 构建DJ-1真核表达载体，筛选DJ-1稳定高表达的H9c2心肌细胞系；在此基础上，探讨DJ-1高表达能否对抗模拟缺血再灌注（sI/R）所诱发的氧化应激损伤，并进一步探求其可能的机制。 方法： 1.根据大鼠DJ-1基因序列（NM₀57143.1, CDS298~867），设计特异性克隆引物，提取大鼠心肌样细胞系H9c2细胞总RNA，应用RT-PCR方法获取DJ-1全长cDNA，克隆至真核表达载体pFLAG-CMV-4，构建DJ-1真核表达重组质粒（pFLAG-CMV-4-DJ-1），应用菌落PCR及DNA测序进行鉴定，确认后转染H9c2细胞，经G418选择性培养筛选出两株DJ-1稳定高表达的H9c2细胞系（H9c2/DJ-1-A和H9c2/DJ-1-B），并通过Western blot测定稳定转染细胞中DJ-1蛋白的表达而加以鉴定，同时筛选稳定转染pFLAG-CMV-4空载质粒的H9c2细胞系（H9c2/Sham）作为对照用于后续细胞实验； 2.各取未转染的H9c2细胞、阴性对照的H9c2/Sham细胞、DJ-1高表达的H9c2/DJ... 

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英缩略词表
第1章 引言
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒、菌株来源
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 实验主要仪器和设备
    2.2 实验方法与步骤
        2.2.1 主要试剂的配制
        2.2.2 细胞培养
        2.2.3 RT-PCR 方法克隆野生型 DJ-1 全长 cDNA 序列
        2.2.4 基因重组技术
        2.2.5 基因转导技术
        2.2.6 建立 DJ-1 基因稳定高表达的 H9c2 细胞系
        2.2.7 H9c2 细胞模拟缺血再灌注（sI/R）损伤模型的建立
        2.2.8 实验设计及分组
        2.2.9 观察指标及方法
    2.3 数据处理
第3章 结果
    3.1 DJ-1 真核表达质粒构建的结果
        3.1.1 RT-PCR 扩增大鼠 DJ-1 cDNA 的结果
        3.1.2 重组质粒 pFLAG-CMV-4-DJ-1 的菌落 PCR 鉴定结果
        3.1.3 重组质粒 pFLAG-CMV-4-DJ-1 的测序鉴定的结果
    3.2 DJ-1 基因稳定高表达的 H9c2 细胞系的建立的结果
        3.2.1 H9c2 心肌样细胞对 G418 的敏感性实验结果
        3.2.2 稳定筛选细胞中 DJ-1 蛋白表达的 Western blot 鉴定结果
    3.3 DJ-1 过表达对 H9c2 心肌细胞 sI/R 损伤的影响
    3.4 DJ-1 高表达对 sI/R 所诱发的氧化应激的影响
    3.5 DJ-1 高表达对 H9c2 心肌细胞 sI/R 损伤后 ROS 生成的影响
    3.6 DJ-1 高表达对 H9c2 心肌细胞内抗氧化酶活性的影响
    3.7 DJ-1 高表达对 H9c2 心肌细胞内抗氧化酶 MnSOD、CAT 及 GPx 表达的影响
第4章 讨论
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果
综述
    参考文献



本文编号：3725230