重组人骨形成蛋白成骨分化及其定量测活的研究

发布时间：2023-02-10 21:30

　　骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的发现证实了骨形成的诱 导学说，为难治性骨折和骨缺损的治疗提供新的希望。从1988年Wozney首次 克隆人BMP cDNA基因，至今已发现近20种人BMP。BMP属于TGF-β超家族 成员，不仅在骨骼的发育和再生修复中发挥关键作用，而且在中胚层的诱导 和分化、造血组织的形成和发育、神经系统的发育和修复等方面都起着重要 作用。因而对BMP的研究不仅有重要的理论意义，而且还具有广阔的临床应 用前景。从骨组织提取BMP，方法烦琐、收获量少、纯度低、重复性差，因 此，用基因工程制备BMP就成为将BMP推向应用的必然途径。国内外在COS、 CHO、昆虫等真核细胞中已经表达得到不同种人BMP，但表达量低，成本昂 贵；我研究组率先在大肠杆菌中高表达获得具诱骨活性的人BMP-2和-3羧基 端肽，为BMP的研究和应用提供了新来源。 然而BMP的研究和应用遇到了一大难题——至今还没有理想的定量测 定BMP生物学活性的方法，这大大限制了BMP临床应用的进度。目前国内 外对BMP的测活，基本上还是沿用Urist最早采用的体内植...

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【学位级别】：博士

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文献综述
    一、 BMP研究进展
    二、 成骨分化特异性转录因子Cbfal
前言
实验部分
    第一部分 rhBMP2成骨分化作用的研究
        实验材料
        实验方法
            一、 rhBMP的表达制备
            二、 rhBMP诱骨活性实验
            三、 细胞培养
            四、 ALP活性测定
            五、 OC含量的测定
            六、 细胞蛋白质含量测定
            七、 MTT法测定细胞活性
        实验结果
            一、 rhBMP纯化结果
            二、 rhBMP2诱骨组织学观察
            三、 ALP测定结果
            四、 OC含量测定
            五、 细胞内蛋白质含量测定
            六、 rhBMP2对细胞增殖的影响
        讨 论
            一、 关于BMP诱骨活性及其应用前景
            二、 关于BMP的活性检测
    第二部分 rhBMP定量测活方法的建立
        实验材料
        实验方法
            一、 RNA提取
            二、 反转录
            三、 细胞基因组DNA提取
            四、 PCR
            五、 质粒提取、细菌转化及电泳等
            六、 细胞转染
            七、 抗性细胞的筛选
            八、 单克隆细胞的挑选
            九、 单克隆细胞稳定性检验
            十、 Luciferase活性测定
            十一、 核酸杂交
            十二、 rhBMP-2m诱骨活性比较
        实验结果
            一、 RT-PCR或PCR
            二、 序列分析
            三、 载体构建
            四、 载体Luciferase基础活性的测定
            五、 不同细胞克隆Luciferase活性比较
            六、 单克隆细胞生长特性
            七、 稳定转染单克隆细胞的鉴定
            八、 不同单克隆细胞对rhBMP-2反应性
            九、 不同种rhBMP活性比较
            十、 不同方法复性的rhBMP-2活性比较
            十一、 rhBMP-2与rhBMP-2对照品比较
            十二、 不同细胞因子对单克隆细胞Luciferase活性影响
            十三、 不同方法复性rhBMP-2诱骨的组织学观察
        讨 论
            一、 关于Luciferase报告基因系统
            二、 关于基因稳定转染与外源基因整合稳定性问题
            三、 关于稳定转染单克隆细胞用于rhBMP测活的问题
小结
参考文献
致谢



本文编号：3739949