甲型H1N1流感病毒HA/HA1基因真核载体构建与腺病毒包装及其初步表达

发布时间：2023-04-09 15:03

　　2009年3月18日在墨西哥首先出现甲型H1Nl流感,并发现病毒在人与人之间进行传播和蔓延,很快在国际上造成爆发。根据世界卫生组织疫情通报,截止2010年3月7日,甲型H1Nl流感导致全球至少16713人死亡。此次病原体为发生基因重排的、同时含禽、猪、人、流感病毒核酸序列的新型H1N1流感病毒。甲型H1N1基因组为8节段负链RNA,共编码10种与病毒功能和结构相关的蛋白质,其中血凝素(Hemagglutinin,HA)是流感病毒囊膜纤突的主要成分之一,也是流感病毒的主要表面糖蛋白,能诱导机体产生保护性的中和抗体。因此,血凝素HA在流感的预防控制与诊断中有着重要的作用。 本研究从NCBI上获得2009年4月来自美国不同州的14个H1N1-HA核酸序列,经核酸序列比对分析,得到共有序列。按照人类密码子使用频率表对共有序列进行优化并全基因合成。把优化后的基因插入到真核表达载体pSNAV中,构建了真核表达质粒pSNAV-Mod.HA与pSNAV-Mod.HA1;质粒转染BHK细胞,经G418筛选后,获得细胞单克隆,用免疫荧光及Western blot技术检测其表达,结果显示两者皆可在BHK细胞...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要 ABSTRACT 第一章 甲型H1N1 流感病毒研究进展
1.1 甲型H1N1 流感的病原学特征
    1.1.1 甲型H1N1 流感病毒的形态与结构
    1.1.2 甲型H1N1 流感病毒基因及其产物
    1.1.3 甲型H1N1 流感病毒的流行病学
    1.1.4 流感的流行情况回顾
    1.1.5 血凝素(Hemagglutinin，HA)与甲型流感病毒致病性的关系
    1.1.6 本试验研究的目的和意义 第二章 甲型H1N1 流感病毒血凝素基因HA 和HA1 真核载体的构建及其蛋白初步表达
2.1 材料
    2.1.1 核酸序列、质粒、菌株和细胞株
    2.1.2 工具酶、试剂和仪器
2.2 方法
    2.2.1 H1N1-HA 全基因序列的获得与氨基酸序列分析
    2.2.2 HA 基因的密码子优化
    2.2.3 真核表达质粒的构建及制备
    2.2.4 BHK 细胞培养
    2.2.5 G418 最佳浓度的确定
    2.2.6 FuGENE?HD 介导的真核表达质粒转染和单克隆的筛选及培养
    2.2.7 间接免疫荧光检测HA 与HA1 基因在BHK 细胞的表达
    2.2.8 Western blot 检测Mod.HA 和Mod.HA1 在BHK 细胞中的表达
2.3 结果与分析
    2.3.1 14 个最新H1N1-HA 氨基酸序列的同源性比较
    2.3.2 真核表达载体的酶切鉴定
    2.3.3 真核表达质粒序列测定
    2.3.4 稳定表达H1N1-HA 与H1N1-HA1 细胞系的建立
    2.3.5 间接免疫荧光与Western blot 检测
2.4 讨论
2.5 小结 第三章 甲型H1N1 流感病毒血凝素基因 HA1 的腺病毒包装
3.1 材料
    3.1.1 腺病毒包装系统和细胞
    3.1.2 核酸序列及质粒和菌株
    3.1.3 工具酶、试剂和仪器
    3.1.4 H1N1-HA1 基因序列的获得与氨基酸序列分析
    3.1.5 HA1 基因的密码子优化
3.2 方法
    3.2.1 表达载体的构建和腺病毒包装
    3.2.2 重组腺病毒的传代和大量扩增
    3.2.3 重组腺病毒的鉴定
3.3 结果
    3.3.1 真核表达质粒pDC315- Mod.HA1 的酶切鉴定
    3.3.2 真核表达质粒pDC315- Mod. HA1 序列测定
    3.3.3 重组腺病毒在293 细胞中的典型病变
    3.3.4 重组腺病毒的鉴定结果
3.4 讨论
3.5 小结 结论 参考文献 致谢 作者简介



本文编号：3787228