嘌呤能受体P2Y6在抗病毒免疫中的功能和机制研究

发布时间：2017-05-21 09:10

  本文关键词：嘌呤能受体P2Y6在抗病毒免疫中的功能和机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胞外核苷酸作为“危险信号”在免疫调控中发挥着重要的作用。细胞在炎症、损伤、死亡等情况下会释放核苷酸,通过与细胞膜上的核苷酸受体P2家族结合,从而引起细胞一系列生理功能的改变。P2受体家族有两个亚型：P2X受体和P2Y受体。P2Y6是P2Y家族的重要成员,已发现其对多种细胞因子的产生发挥调节作用。我们之前的研究表明,UDP及其受体P2Y6能够通过招募单核巨噬细胞提高宿主抗细菌感染的能力。但是,P2Y6在抗病毒功能方面的研究还未有报道。本研究中,我们发现UDP/P2Y6对水泡性口炎病毒VSV诱导的免疫反应具有正调控作用。首先,VSV感染可促进RAW264.7细胞中P2Y6表达的上调及其特异性配体UDP释放的增多。同时,UDP能够降低VSV病毒和GFP-慢病毒对细胞的感染率,这种效应能够被P2Y6特异性拮抗剂MRS2678抑制。在L929细胞中稳定干扰P2Y6后,VSV诱导的细胞死亡和病毒复制明显增加。进一步的机理研究表明,UDP/P2Y6的抗病毒感染功能是通过P38-JNK/ATF2-cJUN信号通路促进IFN-β的表达而实现的,且VSV诱导的细胞凋亡可以促进UDP通过自分泌或旁分泌的方式激活免疫细胞上的P2Y6受体。总之,我们的研究证明了UDP及其受体P2Y6在抗病毒免疫中的重要作用。这一研究结果意味着UDP/P2Y6可能作为病毒性疾病预防和治疗的一个重要靶点。
【关键词】：UDP P2Y_6 VSV IFN-β 危险信号
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 第一章 引言10-17
• 一. 病毒感染疾病及其危害性10-11
• 二. 模式识别与Ⅰ型干扰素的诱导11-13
• 三. 胞外核苷酸与危险信号13-15
• 四. 胞外核苷酸受体家族15-16
• 五. 本研究的目的、内容及意义16-17
• 第二章 材料与方法17-40
• 一. 主要研究内容17-19
• 1. 研究流程和技术路线示意图17-18
• 2. 研究工作内容18-19
• 二. 实验材料19-22
• 1. 实验细胞19
• 2. 主要试剂与试剂盒19-20
• 3. 主要实验仪器20
• 4. 主要溶液配制20-22
• 三. 实验方法22-40
• 1. 荧光定量PCR和RT-PCR22-25
• 2. 细胞增殖实验(MTS)25-26
• 3. 免疫印迹实验(Western Blotting)26-27
• 4. 脂质体转染与荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay)27-29
• 5. 载体构建实验(Vector construct)29-31
• 6. 定点突变实验31
• 7. 慢病毒包装及稳转株筛选实验31-33
• 8. 干扰素介导的抗病毒活性测量实验(结晶紫染色法)33-34
• 9. 酶联免疫吸附实验(ELISA)34
• 10. GFP-慢病毒包装及感染实验34-36
• 11. 流式细胞仪检测细胞凋亡技术(Annexin V/PI双染色法)36
• 12. 荧光偏振实验检测UDP释放(Transcreener UDP~2 FP Assay)实验36-37
• 13. VSV病毒扩增及滴度测定实验37-40
• 第三章 实验结果40-64
• 一. VSV感染与UDP释放及P2Y_6表达之间的关系40-43
• 1.1 VSV感染上调P2Y_6的表达40-41
• 1.2 VSV感染促进细胞释放UDP41-42
• 1.3 讨论与小结42-43
• 二. UDP/P2Y_6提高细胞抗病毒感染能力43-50
• 2.1 P2Y_6特异性性激动剂UDP和抑制剂MRS2578对细胞的增殖无显著影响43-45
• 2.2 P2Y_6提高细胞抗VSV病毒及GFP-慢病毒感染的能力45-46
• 2.3 稳定干扰P2Y_6后L929细胞抗VSV感染能力降低46-49
• 2.4 讨论与小结49-50
• 三. P2Y6激动剂UDP促进细胞分泌干扰素β50-53
• 3.1 UDP直接作用可上调RAW264.7中IFN-β的mRNA表达水平50
• 3.2 UDP可协同VSV提高IFN-β的产生50-52
• 3.3 讨论与小结52-53
• 四. UDP/P2Y_6通过IFN-β提高细胞抗病毒感染的分子机制53-58
• 4.1 UDP可激活AP-1(ATF-2/c-JUN)相关信号通路53-55
• 4.2 UDP上调IFN-β的表达依赖于MAPKs/AP-1信号通路55-57
• 4.3 讨论与小结57-58
• 五. VSV感染后细胞通过Pannexin和Connexin通道释放UDP58-61
• 5.1 VSV感染引起的UDP释放能够被CBX和FFA抑制58-59
• 5.2 VSV感染引起凋亡蛋白Caspas-3的激活59-60
• 5.3 讨论与小结60-61
• 六. 研究小结与展望61-64
• 第四章 综述64-71
• 一. 病毒感染与模式受体64-65
• 二. Ⅰ型干扰素的诱导及其抗病毒机制65-66
• 三. 胞外核苷酸及其受体66-71
• 3.1 对核苷酸生理功能的认识过程66-67
• 3.2 核苷酸释放机制67-68
• 3.3 胞外核苷酸代谢68
• 3.4 胞外核苷酸受体68-69
• 3.5 胞外核苷酸的免疫调控功能69-71
• 第五章 参考文献71-75
• 附录Ⅰ 缩略词75-77
• 附录Ⅱ 攻读硕士学位期间科研工作成果77-79
• 致谢79

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