鼠伤寒沙门菌pat/cobB缺失株的构建及其应对酸压力的研究

发布时间：2023-06-23 18:31

　　作为肠道细菌,鼠伤寒沙门菌(Salmonella spp.)需要克服胃中酸性环境,才能进一步入侵宿主肠道上皮细胞。已有研究表明,沙门菌已经进化出多种应答机制,增强自身在酸性环境下的生存。对于沙门茵抗酸机制研究最多的是酸耐受应答(Acid tolerance response, ATR).ATR指经过弱酸的适应,在随后的致死酸性条件下细菌存活能力增强的现象。因而,经过ATR的沙门菌可以更好地抵御胃酸,增加入侵力以及毒力,导致人或其他宿主患病的几率升高[1]。目前,两个pH依赖的ATR已经知道,即对数期ATR和平台期ATR。在这两个过程中都需要诱导合成多种酸激蛋白(Acid shock proteins, ASPs),保护和修复在酸压力下受到损伤的大分子,这些大分子分别在沙门菌的不同生长时期发挥着作用。同时沙门菌还具有赖氨酸和精氨酸两种脱羧系统,该系统利用氨基酸转运泵将胞内的旷泵出体外,从而在强酸下维持胞内pH相对稳定。原核生物的乙酰化研究主要是对沙门茵的研究。在沙门茵体内,cobB负责编码Sir2同源蛋白,行使去乙酰化功能；pat编码乙酰基转移酶(YfiQ),具有乙酰化功能[2]。基于沙...

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
符号与缩略语说明
第一章 文献综述
    1 沙门菌对酸性压力的应答机理
        1.1 鼠伤寒沙门菌的概述
        1.2 鼠伤寒沙门菌酸耐受
        1.3 展望
    2 蛋白质乙酰化修饰进展
        2.1 真核生物乙酰化修饰
        2.2 原核生物乙酰化修饰
    3 本研究的目的及主要内容
        3.1 研究目的
        3.2 主要内容
第二章 鼠伤寒沙门菌乙酰化酶/去乙酰化酶编码基因pat/cobB敲除株构建
    1 实验材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 培养基
        1.3 酶、抗生素和化学试剂
        1.4 主要仪器
    2 方法
        2.1 质粒DNA的小量提取
        2.2 打靶分子DNA片段扩增
        2.3 电转感受态细胞制备和转化
        2.4 制备含pKD46的沙门菌感受态细胞
        2.5 打靶分子DNA片段转化
        2.6 重组克隆的鉴定
        2.7 氯霉素抗性消除
    3 实验结果
        3.1 扩增敲除片段
        3.2 同源重组
        3.3 消除抗性
    4 讨论
第三章 鼠伤寡沙门菌酸耐受应答检测
    1 实验材料
        1.1 菌株
        1.2 培养基
        1.3 化学试剂
        1.4 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 生长曲线测定
        2.2 对数期酸耐受应答检测
        2.3 平台期酸耐受应答检测
    3 实验结果
        3.1 敲除前后菌株长势无差异
        3.2 对数期ATR
        3.3 平台期ATR
    4 讨论
第四章 鼠伤寒沙门菌酸抗检测
    1 实验材料
        1.1 菌株
        1.2 质粒
        1.3 试剂和酶
        1.4 引物
    2 实验方法
        2.1 菌株构建
        2.2 转化
        2.3 对数期抗酸检测
        2.4 平台期抗酸检测
        2.5 诱导Pat时抗酸检测
    3 实验结果
        3.1 pQE80YX1-pat构建
        3.2 对数期抗酸
        3.3 平台期抗酸
        3.4 诱导Pat时对数期抗酸
        3.5 诱导Pat时平台期抗酸
    4 讨论
第五章 鼠伤寒沙门菌酸环境下乙酰化谱的变化
    1 实验材料
        1.1 菌株
        1.2 试剂
        1.3 仪器
    2 实验方法
        2.1 细菌培养
        2.2 细胞裂解物的制备
        2.3 免疫印迹试验(western blotting)
    3 赖氨酸乙酰化修饰的免疫印迹结果
    4 讨论
第六章 鼠伤寒沙门菌胞内pH检测
    1 实验材料
        1.1 质粒
        1.2 抗生素和化学试剂
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 标准曲线绘制
        2.2 细菌胞内pH测量
    3 实验结果
        3.1 pH-相对荧光强度标准曲线
        3.2 胞内pH测量
    4 讨论
第七章 鼠伤寒沙门菌应对酸压力的相关基因转录水平检测
    1 实验材料
        1.1 菌株
        1.2 试剂
        1.3 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 细菌培养
        2.2 RNA抽提
        2.3 总RNA的定量
        2.4 逆转录
        2.5 Quantitative Real-time PCR
    3 实验结果
        3.1 RNA抽提
        3.2 Quantitative Real-time PCR
    4 讨论
第八章 全文总结和讨论
    1 全文总结
    2 讨论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3835088