Ser176/180磷酸化位点突变的IKKα真核表达载体的构建及鉴定

发布时间：2023-09-03 16:46

　　目的构建Ser176/180磷酸化位点突变的核因子κB抑制剂激酶α(IKKα)真核表达载体。方法通过PCR获得带有IKKαSer176/180突变位点和无义突变KpnⅠ位点的片段,以及带有无义突变KpnⅠ位点的片段,两片段分别经过HindⅢ/KpnⅠ以及KpnⅠ/EcoRⅠ双酶切,载体pEGFP经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切后连接。共聚焦显微镜技术观察激活型/死型p EGFPIKKαKA/KD融合蛋白在真核细胞中的定位及其对P65核质易位的影响。Western blot法检测重组蛋白表达。结果测序显示载体构建成功。pEGFP-IKKαKA分布在细胞核和细胞质,并能使P65发生核穿梭。pEGFP-IKKαKD主要分布在细胞质,不能使P65发生核质易位。Western blot结果显示出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建IKKα磷酸化位点激活型及死型的真核表达载体,在真核细胞中可有效表达。pEGFP-IKKαKA/KD在真核细胞中蛋白表达呈现不同定位,对下游P65的核质穿梭调控发挥不同效应。

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【文章目录】：
1材料和方法
    1. 1材料
    1. 2方法
2结果
    2.1重组质粒构建方法优化示意图
    2.2PCR扩增获得目的基因
    2.3重组载体pEGFP-IKKαKA、pEGFP-IKKαKD酶切鉴定
    2.4pEGFP-IKKαKA、pEGFP-IKKαKD进一步酶切鉴定
    2.5pEGFP-IKKαKA和pEGFP-IKKαKD融合蛋白在细胞中的表达和定位
    2.6激酶突变重组载体的磷酸化功能验证
3讨论



本文编号：3845404