两种重要食源性致病菌O血清型分子分型系统的建立、两株不同宿主来源的大肠杆菌比较基因组学和转录组学研究

发布时间：2023-11-14 17:26

　　Ⅰ 食源性致病菌严重危害着食品安全和人类健康,沙门氏菌和副溶血弧菌是两种常见的食源性致病菌。副溶血弧菌广泛分布在世界各地的河口、沿海岸和海洋,是海产品引发食源性疾病最重要的因素。沙门氏菌存在于多种食物中,包括肉、蛋类、奶制品、蔬菜等,可以通过这些食物进入人体,引起伤寒发热、沙门氏菌病等疾病爆发。致病菌感染与细菌血清型有着重要的关系,对致病菌血清型的鉴定对疾病评估、感染的控制和流行病学调查有着重要意义。 本研究完成了副溶血弧菌O血清型决定簇基因序列的破译,筛选出副溶血弧菌所有13种O血清型的特异基因,建立了副溶血弧菌O血清型分型的多重PCR分子分型方法。这一方法经41株副溶血弧菌、21株其它种属细菌验证,具有很好的特异性。对从上海地区海产品中分离到的105份环境样品进行双盲实验检测,均得到正确的结果。灵敏度实验表明,该检测方法可以检测出1ng的基因组DNA,未经富集培养的细菌可以在104CFU/ml的水平被检测到,1CFU/ml的细菌经过富集培养也完全可以得到正确鉴定。每克牡蛎制备的模拟实际样品中含有2到8个CFU的细菌初始量即可通过我们的PCR体系检测到。 另外我们建立了针对沙门氏菌所...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一部分 沙门氏菌和副溶血弧菌基于O血清型分型的分子检测方法的建立
    第一章 引言
        第一节 研究背景简介
            1.1.1 食源性致病菌的研究背景
                1.1.1.1 食源性疾病
                1.1.1.2 食源性疾病的诱因
            1.1.2 两种重要的食源性致病菌
                1.1.2.1 沙门氏菌
                    1.1.2.1.1 沙门氏菌的生物学特性
                    1.1.2.1.2 沙门氏菌的危害性
                    1.1.2.1.3 沙门氏菌引发的的疾病爆发
                1.1.2.2 副溶血弧菌
                    1.1.2.2.1 副溶血弧菌的生物学特性
                    1.1.2.2.2 副溶血弧菌的致病性
                    1.1.2.2.3 副溶血弧菌的毒力因子
                    1.1.2.2.4 副溶血弧菌的流行性
                    1.1.2.2.5 副溶血弧菌的遗传学研究
            1.1.3 食源性致病菌的检测方法
                1.1.3.1 传统检测方法
                1.1.3.2 免疫学方法
                1.1.3.3 分子生物学方法
            1.1.4 微生物检测的靶基因选择
            1.1.5 革兰氏阴性菌O抗原研究进展
                1.1.5.1 革兰氏阴性菌脂多糖
                1.1.5.2 O抗原的功能和结构
                1.1.5.3 沙门氏菌的O抗原研究
                1.1.5.4 副溶血弧菌的O抗原研究
        第二节 本项工作的研究目标、内容和创新性
            1.2.1 研究目标
            1.2.2 研究内容
                1.2.2 1 副溶血弧菌O血清型分型多重PCR方法
                1.2.2.2 沙门氏菌46种O血清型分型芯片
            1.2.3 本研究的创新性
    第二章 材料与方法
        第一节 实验材料
            2.1.1 菌株
                2.1.1.1 用于副溶血弧菌多重PCR检测方法研制的菌株
                    2.1.1.1.1 用于筛选特异基因的副溶血弧菌菌株
                    2.1.1.1.2 用于多重PCR特异性评价的其它种属菌株
                    2.1.1.1.3 用于特异性验证的实际样品来源
                2.1.1.2 用于研制沙门氏菌46种O血清群分型芯片的菌株
                    2.1.1.2.1 用于筛选特异基因及芯片评价实验的沙门氏菌
                    2.1.1.2.2 用于特异性评价试验的其它种属菌株
                2.1.1.3 用于DNA文库构建克隆的受体菌株
            2.1.2 质粒
            2.1.3 引物和探针
            2.1.4 主要酶与试剂
            2.1.5 实验仪器
        第二节 实验方法
            2.2.1 培养基及一些基本试剂的配置
                2.2.1.1 2YT培养基及固体培养基的配制
                2.2.1.2 抗生素和一些酶制剂的配置
            2.2.2 细菌基因组DNA的提取
            2.2.3 鸟枪法DNA文库的构建
                2.2.3.1 O血清型决定簇的扩增及产物的纯化
                    2.2.3.1.1 PCR反应体系
                    2.2.3.1.2 PCR程序
                    2.2.3.1.3 PCR产物的检测
                    2.2.3.1.4 PCR产物纯化
                2.2.3.2 DNA产物片段化及补平、连接反应
                    2.2.3.2.1 DNA产物片段化
                    2.2.3.2.2 DNA片段化产物的补平
                    2.2.3.2.3 与质粒的连接反应
                2.2.3.3 连接产物电转化及质粒提取
                    2.2.3.3.1 感受态细胞制备
                    2.2.3.3.2 电转化连接产物
                    2.2.3.3.3 质粒提取
                2.2.3.4 构建的DNA文库测序
                    2.2.3.4.1 ABI测序
                    2.2.3.4.2 核苷酸序列拼接
                    2.2.3.4.3 生物信息学方法进行序列分析
            2.2.4 Solexa/Illumina测序
                2.2.4.1 Solexa Paired-end样品制备
                2.2.4.2 Solexa双末端测序
                2.2.4.3 Solexa测序序列拼接
            2.2.5 特异基因的筛选
                2.2.5.1 副溶血弧菌特异基因的筛选
                2.2.5.2 沙门氏菌特异基因的筛选
            2.2.6 多重PCR体系的建立
                2.2.6.1 副溶血弧菌多重PCR体系
                2.2.6.2 沙门氏菌多重PCR体系
            2.2.7 基因芯片的研制
                2.2.7.1 沙门氏菌基因芯片的点制
                2.2.7.2 芯片杂交
                    2.2.7.2.1 多重PCR产物纯化
                    2.2.7.2.2 荧光标记
                    2.2.7.2.3 杂交反应
                    2.2.7.2.4 芯片扫描
            2.2.8 模拟样品实验
                2.2.8.1 副溶血弧菌模拟样品实验
                2.2.8.2 沙门氏菌模拟样品实验
    第三章 结果与分析
        (Ⅰ)副溶血弧菌多重PCR分子分型方法建立
            第一节 副溶血弧菌O2,O6,O9,O10,O11,O13 O血清型决定簇的分子鉴定和进化分析
                3.1.1 副溶血弧菌O血清型决定簇序列的获得
                3.1.2 副溶血弧菌O2O血清型决定簇的鉴定
                3.1.3 副溶血弧菌O6O血清型决定簇的鉴定
                3.1.4 副溶血弧菌O9O血清型决定簇的鉴定
                3.1.5 副溶血弧菌O10O血清型决定簇的鉴定
                3.1.6 副溶血弧菌O11O血清型决定簇的鉴定
                3.1.7 副溶血弧菌O13O血清型决定簇的鉴定
            第二节 特异引物的筛选及多重PCR体系的确立
                3.2.1 副溶血弧菌13种O血清型特异引物的筛选
                    3.2.1.1 副溶血弧菌O血清型决定簇序列分析
                    3.2.1.2 副溶血弧菌高度相似O血清型序列比对分析
                    3.2.1.3 副溶血弧菌O血清型特异引物筛选
                3.2.2 副溶血弧菌多重PCR体系建立
            第三节 副溶血弧菌多重PCR体系性能评价实验
                3.3.1 多重PCR体系特异性实验
                    3.3.1.1 副溶血弧菌和其它种属菌株的特异性检测结果
                    3.3.1.2 分离自临床样品中的副溶血弧菌双盲样品检测结果
                3.3.2 灵敏度实验
                    3.3.2.1 DNA灵敏度
                    3.3.2.2 菌数灵敏度
                3.3.3 模拟样品实验
        (Ⅱ)沙门氏菌46种O血清群分子分型基因芯片的研制
            第二节 特异引物的筛选和多重PCR体系确立
                3.1.1 沙门氏菌O血清群特异引物的设计
                    3.1.1.1 沙门氏菌O抗原基因簇序列分析
                    3.1.1.2 沙门氏菌相似度较高的几个O抗原基因簇序列比较
                    3.1.1.3 沙门氏菌和相似度较高的大肠杆菌O抗原基因簇
                    3.1.1.4 沙门氏菌46个血清群特异基因的筛选
                    3.1.1.5 沙门氏菌特异引物的设计和筛选
                3.1.2 用于扩增靶基因的多重PCR的设计和优化
            第二节 沙门氏菌46种O血清群探针的设计和筛选
                3.2.1 特异探针的设计
                3.2.2 特异探针的筛选
            第三节 沙门氏菌芯片性能评价实验
                3.3.1 沙门氏菌芯片特异性实验
                    3.3.1.1 所有的沙门氏菌杂交结果
                    3.3.1.2 非沙门氏菌菌株杂交结果
                3.3.2 沙门氏菌芯片灵敏度实验
                    3.3.2.1 DNA灵敏度实验
                    3.3.2.2 菌数度灵敏度实验
                3.3.3 沙门氏菌芯片双盲实验
                3.3.4 沙门氏菌芯片模拟样品实验
    第四章 结论与讨论
第二部分 两株不同宿主来源的大肠杆菌O156：H25的比较基因组学和转录组学研究
    第一章 引言
        第一节 研究背景简介
            1.1.1 微生物基因组学研究进展
                1.1.1.1 基因组
                1.1.1.2 基因组学
                1.1.1.3 基因组学的研究策略
                1.1.1.4 功能基因组学
                1.1.1.5 比较基因组学
            1.1.2 微生物转录组学研究进展
                1.1.2.1 转录组学
                1.1.2.2 转录组学的研究策略
            1.1.3 DNA测序技术发展
                1.1.3.1 第一代测序法
                    1.1.3.1.1 Sanger双脱氧链末端终止法测序
                    1.1.3.1.2 Gilbert化学裂解法
                    1.1.3.1.3 焦磷酸测序技术
                1.1.3.2 第二代测序技术
                    1.1.3.2.1 454 GS FLX测序技术
                    1.1.3.2.2 Solexa测序技术
                    1.1.3.2.3 ABI测序技术
                1.1.3.3 第三代测序技术
            1.1.4 肠道致病性大肠杆菌研究进展
                1.1.4.1 肠出血性大肠杆菌的致病因子
                1.1.4.2 肠出血性大肠杆菌的致病机制
                1.1.4.3 LEE致病岛
                1.1.4.4 效应子蛋白
                1.1.4.5 重要的致病因子
        第二节 本工作的研究内容、目标和创新性
            1.2.1 本实验研究背景
            1.2.2 研究内容
                1.2.2.1 E.coli O156：H25菌株的比较基因组学研究
                1.2.2.2 E.coli O156：H25菌株的比较转录组学研究
            1.2.3 研究目标
            1.2.4 创新性
    第二章 材料与方法
        第一节 实验材料
            2.1.1 菌株
            2.1.2 细胞株
            2.1.3 试剂
        第二节 实验方法
            2.2.1 基因组测序
            2.2.2 基因组序列拼接
            2.2.3 基因预测和注释
            2.2.4 基因组多序列比对分析
            2.2.5 转录组测序样本制备
                2.2.5.1 样本准备
                2.2.5.2 RNA提取
                2.2.5.3 RNA纯化和富集
                2.2.5.4 RNA文库构建
                2.2.5.5 转录组测序
                2.2.5.6 转录组测序结果处理
            2.2.6 细胞粘附实验
                2.2.6.1 细胞培养
                2.2.6.2 细胞粘附
            2.2.7 细菌动力实验
    第三章 结果与分析
        第一节 基因组学比较
            2.1.1 PT199和CB647基本特性差别
            2.1.2 PT199和CB647基因组概况
            2.1.3 PT199和CB647比较
                2.1.3.1 特异基因分析
                2.1.3.2 Snp和假基因分析
                2.1.3.3 效应子蛋白比较
            2.1.4 12株E.coli O156：H25基因组比较
        第二节 转录组学比较
            2.2.1 PT199和CB647转录组
                2.2.1.1 吸附后基因表达变化
                2.2.1.2 PT199和CB647基因表达比较
            2.2.2 几类与致病性相关基因的转录组变化
                2.2.2.1 LEE致病岛转录组变化
                2.2.2.2 鞭毛相关基因转录组变化
                2.2.2.3 菌毛相关基因转录组变化
    第四章 结论与讨论
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3863856