h IGF-1基因转染人脐血间充质干细胞的实验研究

发布时间：2017-05-22 18:33

  本文关键词：h IGF-1基因转染人脐血间充质干细胞的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：体外研究hIGF-1基因转染人脐带血间充质干细胞的实验学方法,检测并观察基因转染后脐带血间充质干细胞(hUCB-MSCs)的生物学变化。 方法：利用密度梯度离心法与细胞贴壁法相结合分离培养hUCB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。构建真核表达质粒并以X-tremen HP介导将含hIGF-1基因的质粒pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ转染hUC-MSCs,倒置荧光显微镜观察转染后细胞内绿色荧光蛋白的表达,酶联免疫吸附试验检测转染后不同时间段细胞上清液中hIGF-1的浓度,免疫荧光与RT-PCR检测hIGF-1在细胞中的表达,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原表达。 结果：密度梯度离心法与细胞贴壁法相结合可获得纯度较高的hUCB-MSCs,流式细胞仪细胞表面抗原标志CD90、CD105、CD146表达阳性,CD34、CD45、Anti-HLA-DR表达阴性。经X-tremen HP介导hIGF-1目的基因可导入UCB-MSCs其转染效率为(28.63±7.59)%,免疫荧光和RT-PCR鉴定均检测到hIGF-1的表达。转染后细胞形态由长梭形逐渐变为圆形或椭圆形,以后逐渐变为多角形。ELISA检测hIGF-Ⅰ蛋白质分泌在48h达到高峰(34.68±1.4ng/ml),与对照组相比,具有显著性差异(p0.01)。细胞免疫组化结果显示经转染后的细胞Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ,密度梯度离心法与细胞贴壁法相结合可成功分离出人脐血间充质干细胞,以脂质体介导hIGF-Ⅰ基因可成功转染hUCB-MSCs,目的基因和标记基因均可获得表达,转染后细胞可表达II型胶原。
【关键词】：脐血 干细胞 人胰岛素样生长因子1 基因转染 脂质体
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-4
• 目录4-5
• 引言5-6
• 第一章 材料与方法6-11
• 1.1 材料6
• 1.1.1 主要试剂6
• 1.1.2 主要仪器6
• 1.26-11
• 1.2.1 构建pIRES2-EGFP-hIGF-I6-7
• 1.2.2 人脐血间充质干细胞的分离培养7-8
• 1.2.3 流式细胞仪检测细胞表面标志物8
• 1.2.4 h UCB-MSCs生长曲线的测定8
• 1.2.5 pIRES2-EGFP-hIGF-I转染hUCB-MSCs8-9
• 1.2.6 ELISA检测h IGF-1的分泌表达9
• 1.2.7 细胞免疫荧光检测h IGF-1在h UCB-MSCS中表达9
• 1.2.8 RT-PCR检测h IGF-1在转录水平的表达9-10
• 1.2.9 检测h UCB-MSCs中Ⅱ型胶原的表达10-11
• 第二章 结果11-20
• 2.1 真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-I的鉴定11-13
• 2.2 h UCB-MSCs的分离培养与传代13-15
• 2.3 细胞流式仪检测结果15-16
• 2.4 描记h UCB-MSCs生长曲线16
• 2.5 pIRES2-EGFP-hIGF-I转染hUCB-MSCs16-17
• 2.6 h lGF-1在h UCB-MSCs表达的检测17-19
• 2.7 免疫组化检测转染后h UCB-MSCs中Ⅱ型胶原的表达19-20
• 第三章 讨论20-22
• 结论22-23
• 参考文献23-25
• 综述25-34
• 参考文献31-34
• 攻读学位期间的研究成果34-35
• 致谢35-37

【参考文献】

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本文编号：386514