MicroRNA-23a/27a/24-2在红系分化中的功能及作用机制研究

发布时间：2024-02-03 16:42

　　MicroRNAs (miRNAs)在红系分化调控中发挥着重要作用。尽管已经报道了一些调控红系分化的miRNA,但是关于红系分化特异转录因子GATA-1如何通过miRNA促进红系分化的机制,目前尚不清楚。本文对GATA-1转录调控的三个小RNA, miR-23a、 miR-27a和miR-24-2(miR-23a/27a/24)在红系分化过程中的功能和分子机制进行了深入研究。 第一部分工作,我们通过miRNA表达芯片对GATA-1潜在调控并在红系分化过程中表达逐渐上调的miRNA进行了系统性分析,从中筛选出miR-23a作为进一步的研究对象。在CD34+造血干细胞和红白血病K562细胞中,我们验证了GATA-1对miR-23a的正调控作用以及miR-23a在红系分化中的表达变化。我们也通过miRNA过表达及敲低实验,在CD34+造血干细胞、斑马鱼及小鼠中证明了miR-23a促进红系分化的功能。在分子机制的研究中,我们发现其促进红系分化的功能是通过靶向抑制酪氨酸磷酸酶SHP2的表达来实现。第二部分工作,我们对miR-23a基因簇的另外两个成员miR-27a和miR-24(miR-24-2...

【文章页数】：123 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
前言
材料与方法
    一、实验材料
        1. 工具酶及分子量Marker
        2. 主要生化试剂
        3. 培养基、血清及添加剂
        4. 细胞因子
        5. 试剂盒
        6. 同位素标记化合物
        7. 菌株
        8. 质粒
        9. 细胞系
        10. 人脐带血标本
        11. 引物、探针及morpholino
        12. 生物信息学分析软件
        13. 主要仪器及设备
    二、实验方法
        1. 细胞学实验
            1.1 细胞系的诱导
            1.2 细胞转染
            1.3 联苯胺染色
            1.4 造血干细胞的体外培养
        2. 分子学实验
            2.1. Real-time PCR
            2.2. MiRNA real-time PCR
            2.3. MiRNA的PAGE及Northern杂交
            2.4. 染色质免疫共沉淀(ChIP)
            2.5. 重组质粒的构建
            2.6. 质粒DNA的提取
            2.7. 慢病毒的包装
            2.8. Western blot
            2.9. 双萤光报告实验
        3. 斑马鱼实验
            3.1. 原位杂交(In situ hybridization)
            3.2. 双重原位杂交(Double in situ hybridization)
            3.3. O-Dianisidine染色
        4. 小鼠实验
        5. MiRNA microarray
结果
    第一部分 MIR-23a在红系分化过程中的功能及分子机制
        1. 表达谱分析筛选受GATA-1正向调控的miRNAs
            1.1. MiRNA基因芯片表达分析结果
            1.2. 筛选在红系分化过程中受GATA-1正向调控的miRNAs
        2. MiR-23a在红系分化过程中的功能
            2.1. MiR-23a在红系分化过程中的表达
            2.2. 验证GATA-1对miR-23a的正向调控
            2.3. MiR-23a在K562细胞红系分化中的功能
            2.4. CD34+造血干细胞向红系分化过程中miR-23a的功能
        3. MiR-23a促进红系分化的分子机制
            3.1. MiR-23a成熟序列的同源性分析
            3.2. 验证SHP2是miR-23a的靶基因
            3.3. 检测SHP2在红系分化过程中的表达
            3.4. CD34+造血干细胞中验证miR-23a靶向抑制SHP2的表达
            3.5. Rescue实验证明miR-23a通过抑制SHP2表达促进红系分化
        4. SHP2抑制红系分化
            4.1. SHP2在K562细胞中的功能
            4.2. CD34+造血干细胞中验证SHP2的功能
        5. 验证由miR-23a介导的GATA-1负调控SHP2的调节回路
            5.1. GATA-1抑制SHP2蛋白水平的表达
            5.2. 在CD34+造血干细胞中miR-23a-GATA1-SHP2调节loop进行验证
        6. MiR-23a在斑马鱼中的功能验证
            6.1. MiR-23a成熟序列在物种中的保守性分析
            6.2. MiR-23a在斑马鱼中的表达
            6.3. MiR-23a在斑马鱼中的功能
            6.4. 0- Dianisidine染色检测敲低miR-23a后斑马鱼血红蛋白的表达
            6.5. 检测敲低miR-23a抑制斑马鱼初级造血
            6.6. 敲低miR-23a抑制斑马鱼红细胞生成
        7. MiR-23a促进小鼠红细胞生成
            7.1. 在小鼠中过表达miR-23a
            7.2. 过表达miR-23a对小鼠造血干细胞向红系分化的影响
            7.3. HE染色检测过表达miR-23a对脾脏红细胞生成的影响
    第二部分 MIR-27a/24在红系分化过程中的功能及分子机制
        1. MiR-27a/24在红系分化过程中的表达
            1.1. K562细胞中miR-27a/24在红系分化过程中的表达
            1.2. CD34+造血干细胞中miR-27a/24在红系分化过程中的表达
        2. GATA-1转录调节miR-27a/24的表达
            2.1. GATA-1在miR-23a/27a/24基因上游promoter区的结合
            2.2. GATA-1正向调节miR-27a/24的表达
            2.3. GATA-1在w//?-27lf/24基因上游promoterlx.的结合随分化的进行逐渐增强
            2.4. 双荧光验证GATA-1对miR-27a/24的正向调节
        3. MiR-27a和miR-24在红系分化中的功能
            3.1. K562细胞中miR-27a/24对红系分化的影响
            3.2. MiR-27a和miR-24对斑马鱼红系分化的影响
            3.3. Mir-27a/24对小鼠红细胞生成的影响
        4. MiR-27a/24促进红系分化的分子机制
            4.1. MiR-27a/24靶向抑制GATA-2的表达
            4.2. GATA-1/2 switch调控miR-27a/24的表达
            4.3. MiR-27a/24调节GATA-1/2 switch开关形成正反馈调控回路
讨论
小结
参考文献
文献综述
    参考文献
英文名词及缩写
攻读博士期间发表的文章
致谢



本文编号：3894420