安全高效HPV 16E7 DNA疫苗的构建及免疫原性分析

发布时间：2024-02-20 23:23

　　背景和目的：近年来，大量细胞学和病毒学研究报道证实多种疾病与人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关。在应用免疫抑制剂的病人或免疫低下的患者，HPV感染机率增高，且有些患者皮损可自行消退(疣，癌前期病变)，提示免疫系统在HPV感染性疾病发生、发展过程中起重要作用。免疫干预治疗将成为HPV治疗的重要手段，DNA疫苗为治疗各种HPV相关感染和肿瘤提供了有力武器，E6、E7蛋白是HPV16治疗性疫苗重要靶抗原。然而DNA疫苗的安全性和免疫效率低是困扰其临床广泛应用的最大障碍。本研究从基因突变和与单纯疱疹病毒(HSV-1)VP22基因融合2个角度构建2种DNA疫苗，并对其免疫原性进行评价。 方法：(1) 载体构建：采用PCR方法突变HPV16E7锌指结合区第58和91位氨基酸。设计含有突变位点的2对引物，采用4次PCR，扩增出含有2个突变位点的片断，将原序列中CYS(半胱氨酸)突变为GLY(甘氨酸)，插入到真核表达载体pcDNA3.1，构建突变型表达载体pcDNA-16ME7。同时将野生型E7片断插入pcDNA3.1，构建pcDNA-16E7，作为对照。另外，PCR扩增VP22序列，插入pc...

【文章页数】：91 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图1一4.PCR扩增HPV16E7l.pBR322/Hinflmarke:l.HPV16阳性宫颈癌组织标本

PCR扩增HPV16E7设计含有BamHI和EocRI酶切位点的扩增全长HPV16E7的引物，扩增出全长基因，与预期结果相同，扩增长度约300Pb(图1一4)。3.PeR扩增突变后E7(ME7)按照材料与方法所述，设计含有HPV16E7第58和91位氨基酸突变位点的引物，经4次P....

图1一5.载体酶切鉴定图1一7.PCR扩增VP22片断

.DNAMarker(DL2000+DL15OO)图1一7.PCR扩增VP22片断1.PBR322H/inflmarker2.VP22片断3.阴性对照5.PcDNA一16ME7序列分析:为了证实突变后序列含有预期的突变位点，采用pUC顾13正向和反向测序引物进行双向测序，结果如图....

图2一1.pcA一VP22/E7转染阳性细胞图2一.2PcDNA一E7转染细胞，胞核

COS一7细胞，在24和4h8时进行免疫荧光染色，结果在24h时PcDNA一16E7、PcDNA一16ME7、PcDNA一E7戊P22均见阳性细胞，前两者着色部位在细胞核，而在pQDNA一E7邝p22转染后细胞浆亦可见着色(图2一1)。在48h时，pcDNA一16ME7阳性细胞消....

图2一4.12%SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和wesetmblot分析

‘卜国医学科学院博卜生毕业论文图2一3.pcDNA一16ME7转染后细胞核裂解kDa97664320l4图2一4.12%SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和wesetmblot分析(1:低分子量蛋白质PeDNA一ME7，PeDNA一3.marker，2，3，4，5分别为peDNA一Vp22....

本文编号：3904678