HBV对人近端肾小管上皮细胞的转分化作用及其机制的研究

发布时间：2017-05-24 18:19

  本文关键词：HBV对人近端肾小管上皮细胞的转分化作用及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 通过将PHY106-HBV质粒（含C基因型HBV的全基因组）转染至体外培养的正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2），，研究乙型肝炎病毒（HBV）在HK-2细胞内的表达和对HK-2细胞转分化的作用及其机制。初步探讨乙型肝炎病毒在乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）中的作用机制。 方法： 将体外培养HK-2细胞，分为HK-2组、HK-2-PHY106组（转染空质粒PHY106组）、HK-2-PHY106-HBV组（转染PHY106-HBV质粒组）和SB203580（转染PHY106-HBV质粒前加入P38丝裂原活化蛋白激酶特异性抑制剂预处理）组。用脂质体lipofectamineTM2000转染HK-2细胞。用电化学发光免疫分析法（ECLIA法）检测各组细胞培养上清液中HBsAg与HBeAg的含量。免疫细胞化学染色检测转染72h后各组E-钙粘素（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。半定量RT-PCR法检测转染72h后转化生长因子-1（TGF-β1）mRNA在各组细胞的表达情况。Westernblot印迹检测转染72h后各组E-cadherin、α-SMA、磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）和P38MAPK（P38丝裂原活化蛋白激酶）的蛋白表达情况及加入P38MAPK特异性抑制剂SB203580后对E-cadherin和α-SMA蛋白表达的影响。 结果: HK-2-PHY106-HBV组细胞培养上清液中可检测到HBsAg和HBeAg的高表达；免疫细胞化学染色及Western印迹均显示HK-2-PHY106-HBV组E-cadherin蛋白表达显著下调（P＜0.05），而α-SMA蛋白表达明显上调（P＜0.05）。RT-PCR法显示HK-2-PHY106-HBV组的TGF-β1mRNA表达上调（P＜0.05）。Western印迹显示HK-2-PHY106-HBV组的p-P38MAPK蛋白表达明显上调（P＜0.05），加入SB203580后p-P38MAPK蛋白表达明显下调（P＜0.05），且能阻止HBV引起的E-cadherin蛋白下调和α-SMA蛋白上调（P＜0.05）。 结论： HBV可在HK-2细胞内高效复制，表达乙肝表面抗原和乙肝e抗原，并且能够导致HK-2细胞转分化，其机制可能是通过激活TGF-β1/P38MAPK信号通路来实现的，P38MAPK的特异性抑制剂SB203580可有效阻止HBV引起的肾小管上皮细胞转分化。
【关键词】：乙型肝炎病毒 人近端肾小管上皮细胞 转染 细胞表型转化 TGF-β1/P38MAPK
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 主要符号表12-13
• 前言13-14
• 材料和方法14-26
• 1 实验材料14-17
• 1.1 细胞株14
• 1.2 质粒14
• 1.3 主要试剂14-15
• 1.4 主要仪器15-16
• 1.5 主要试剂配制16-17
• 1.6 其他17
• 2 实验方法及步骤17-25
• 2.1 细胞的培养与复苏17-18
• 2.2 PHY106-HBV质粒的提取与鉴定18-20
• 2.3 实验分组20
• 2.4 PHY106-HBV转染至人肾小管上皮细胞20
• 2.5 培养上清液中HBsAg与HBeAg的检测20
• 2.6 免疫细胞化学法检测 HK-2 中α-SMA 、E-cadherin 蛋白的表达20-21
• 2.7 HK-2 细胞总 RNA 的提取21-22
• 2.8 RT-PCR 检测 HBV 对 HK-2 细胞 TGF-β1mRNA 表达的影响22-23
• 2.9 HK-2 细胞蛋白的提取23-24
• 2.10 Western blot检测α-SMA、E-cadherin、p-P38MAPK和P38MAPK的表达24-25
• 3 统计学方法25-26
• 结果26-28
• 1 PHY106-HBV 质粒的鉴定结果26
• 2 HBV 对 HK-2 细胞形态学的影响26
• 3 上清液中 HBsAg 与 HBeAg 的检测结果26
• 4 乙型肝炎病毒对 HK-2 细胞 E-cadherin 和α-SMA 蛋白表达的影响26-27
• 5 乙型肝炎病毒对 HK-2 细胞 TGF-β1mRNA 表达的影响27
• 6 乙型肝炎病毒对HK-2细胞p-P38MAPK和P38MAPK蛋白表达的影响27-28
• 讨论28-32
• 结论32-33
• 附图33-38
• 参考文献38-41
• 综述41-48
• 参考文献45-48
• 在校期间取得成果48-49
• 致谢49

【参考文献】

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1 张勇;张t

本文编号：391598