一种新型的抗血管紧张素II的治疗性高血压疫苗的构建、表达及治疗效果的研究

发布时间：2024-04-10 05:36

　　高血压病(Hypertension, HTN)是一种以动脉血压持续偏高为主要表现的慢性疾病,常伴有脂肪和糖代谢紊乱以及心、脑、肾和视网膜等器官组织的不良重塑,其脑卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病等主要并发症,致残、致死率高。据报道,目前全球约有10亿高血压患者,每年有近800万人死于由高血压引起的各种疾病,我国有高血压患者至少2亿,每年新增患者约1000万人。目前治疗高血压主要是通过药物治疗,包括α-受体阻滞剂类,钙通道阻断剂类,血管紧张素转化酶抑制剂类,血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类等。虽然药物治疗疗效明显,但由于患者服药依从性差,药物引起的毒副作用以及机体产生耐药性等原因,导致目前高血压控制率不高,因此世界各国心血管基础研究和临床工作者都在积极探索新的治疗方法和手段,而开发高效、安全的疫苗成为治疗和控制高血压病的一个新的研究方向。 肾素-血管紧张素-醛固酮系统(The renin-angiotensin-aldosteron system, RAAS)过度激活是目前研究的最为清楚,也是最为重要的高血压发病机制,在RAAS中,过多的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)通...

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【学位级别】：博士

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目录
摘要
Abstract
前言
第一部分 携带P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因的重组杆状病毒载体的构建及鉴定
    一、实验材料与方法
        1. 实验材料
            1.1 基因、质粒、菌株、Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统和细胞
            1.2 工具酶及试剂
            1.3 主要仪器
            1.4 引物
        2. 实验方法
            2.1 4AngⅡs基因的获得及保存
                2.1.1 4AngⅡs基因的获得
                2.1.2 4AngⅡs基因的保存
            2.2 重组质粒pT7-18f-2A-4AngⅡs的构建及鉴定
                2.2.1 4AngⅡs基因片段的获得
                2.2.2 载体质粒pT7-18f基因片段的获得
                2.2.3 连接4AngⅡs基因片段和载体pT7-18f基因片段
                2.2.4 重组质粒pT7-18f-4AngⅡs的获得及鉴定
            2.3 重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定
                2.3.1 目的基因P1-2A-4AngⅡs和3ABC的克隆
                2.3.2 将P1-2A-4AngⅡs基因片段克隆至pFastbac-Dual质粒中
                2.3.3 将3ABC基因片段克隆至重组质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs中
                2.3.4 重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鉴定
            2.4 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定
                2.4.1 制备E.coli DH10感受态细胞
                2.4.2 重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC转化E.coli DH10
                2.4.3 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的提取
                2.4.4 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鉴定
            2.5 Sf9细胞的培养
                2.5.1 Grace完全培养基的配制
                2.5.2 Sf9细胞传代培养
                2.5.3 Sf9细胞的培养条件
            2.6 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的包装和扩增
                2.6.1 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC转染sf9细胞
                2.6.2 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的收获及传代
            2.7 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鉴定
                2.7.1 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC基因组的提取
                2.7.2 PCR方法鉴定重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC
                2.7.3 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC颗粒的形态学观察
            2.8 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC病毒滴度的测定
    二、实验结果与分析
        1. 重组质粒pT7-18f-2A-4AngⅡs的构建及鉴定
        2. 重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定
        3. 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定
        4. Bacmid-GFP转染sf9细胞后荧光生成情况
        5. 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC转染sf9细胞后的细胞形态变化情况
        6. PCR验证重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC
        7. 透射电镜下观察重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC颗粒形态结构
        8. 蚀斑实验测定重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC病毒滴度
    三、讨论
第二部分 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的表达、鉴定及免疫原性和治疗效果分析
    一、实验材料和方法
        1. 实验材料
            1.1 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC和细胞
            1.2 实验动物
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器
            1.5 引物
        2. 实验方法
            2.1 Sf9细胞的大规模培养
                2.1.1 Grace完全培养基的配制
                2.1.2 Sf9细胞的冻存
                2.1.3 Sf9细胞的复苏及传代培养
                2.1.4 Sf9细胞的培养条件
                2.1.5 Sf9细胞计数
                2.1.6 Sf9细胞活性测定
            2.2 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的表达及鉴定
                2.2.1 重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC感染sf9细胞
                2.2.2 RT-PCR
                2.2.3 目的蛋白pHAV-4AngⅡs样品的制备和SDS-PAGE凝胶电泳
                2.2.4 Western blot
                2.2.5 间接免疫荧光
                2.2.6 透射电镜下观察目的蛋白pHAV-4AngⅡs的VLP结构
            2.3 目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表达条件的摸索
                2.3.1 Western blot确定目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表达条件
                2.3.2 ELISA确定目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表达条件
            2.4 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的纯化和鉴定
                2.4.1 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的大量制备及纯化
                2.4.2 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的鉴定
                2.4.3 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的浓度测定
            2.5 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的免疫原性和治疗效果分析
                2.5.1 实验动物
                2.5.2 免疫方案
                2.5.3 血清的处理及保存
                2.5.4 血压的测量
                2.5.5 抗AngⅡ抗体滴度的测定
                2.5.6 血清中AngⅡ含量的测定
                2.5.7 对数据进行统计学分析
    二、实验结果与分析
        1. 细胞计数
        2. 细胞病变
        3. RT-PCR
        4. SDS-PAGE和Western blot
        5. 间接免疫荧光
        6. 透射电镜下观察目的蛋白pHAV-4AngⅡs的VLP结构
        7. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的最佳表达时间和MOI值
        8. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的纯化和鉴定
        9. 血压测定
        10. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs免疫大鼠后抗体滴度的测定与分析
        11. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs免疫大鼠后血清中抗原AngⅡ的浓度的测定与分析
        12. 血压值、抗体滴度和AngⅡ水平之间的两两相关性分析
            12.1 血压值和抗体滴度相关性分析
            12.2 血压值和AngⅡ水平相关性分析
            12.3 抗体滴度和AngⅡ水平相关性分析
    三、讨论
小结
展望
参考文献
附录
论文综述
    参考文献
致谢
研究生简历



本文编号：3950231