肠道病毒71型串联表位疫苗的分子设计与免疫效果评价

发布时间：2017-05-26 15:24

  本文关键词：肠道病毒71型串联表位疫苗的分子设计与免疫效果评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）是小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属的重要成员，主要感染5岁以下儿童，是导致手足口病（Hand-Foot-Mouse）的主要病原体，广泛流行于亚洲太平洋地区。该病毒可引起类似于脊髓灰质炎的神经系统症状，是一种重要的新发嗜神经病毒。目前临床上并无针对EV71病毒的有效疫苗和特效药物，疫苗是控制EV71感染的有效手段，许多疫苗候选株包括甲醛灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗以及亚单位疫苗都已取得了很好的实验结果，但是缺乏有效的临床试验数据。 EV71病毒为单股正链RNA病毒，长度约7500bp，包含单一开放阅读框（ORF），ORF首先编码一个多聚蛋白,然后多聚蛋白被切割成VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白和若干个非结构蛋白。在病毒的结构蛋白中，VP1、VP2和VP3暴露于病毒颗粒表面，诱导机体产生免疫应答，决定了病毒的免疫原性，而VP4则完全位于病毒粒子的内部，与病毒的复制翻译有关。目前，许多EV71的线性中和表位已经确定，我们利用软件分析和序列比对筛选出在EV71不同基因亚型之间具有高度保守性的三个表位，它们分别是VP1蛋白上的SP55(氨基酸位置163-177)和SP70（氨基酸位置208-222）以及VP2蛋白上的SP28（氨基酸位置136-150），实验证明它们均可诱导小鼠产生针对EV71病毒的特异性中和抗体，是多表位疫苗的理想靶标。 在本研究中，我们首先构建了EV71多个串联线性中和表位（SP55-SP70-SP28）的原核表达载体，随后对其进行诱导表达，获得了EV71多表位串联重组蛋白mTLNE。将纯化后的mTLNE免疫小鼠，从体液和细胞免疫两个方面，，系统评价mTLNE的免疫效果，并进一步观察免疫血清对小鼠的体内保护效果，明确了mTLNE作为疫苗的可行性。 1. EV71串联线性中和表位mTLNE的设计与构建；我们首先对EV71B细胞表位的保守性进行分析，选择SP55、SP70和SP28三个线性中和表位为靶标，再基于EV71国内流行株AH08/06（GenBank：HQ611148）上三个线性中和表位的的基因序列以及pET32a上的限制性酶切位点设计引物，为使三个表位能够独立的展示各自的抗原表位，在各表位之间插入蛋白Linker序列-（G4S）3。 为同时表达上述三个表位，我们利用重叠PCR技术扩增三个串联表位的基因序列，然后将该PCR产物克隆到pET32a载体中，构建包含mTLNE基因的重组质粒，最后对重组质粒进行核酸序列测定。结果表明成功构建了包含mTLNE基因的原核表达载体。 2．重组蛋白的表达、纯化和鉴定； 将重组质粒转化BL21感受态细胞，用IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE的方法进行鉴定，结果显示：重组质粒转化菌经IPTG诱导后在30KD附近出现了一条带，与预期大小一致，说明重组质粒可在原核细胞中表达目的蛋白。随后又对诱导菌进行超声破碎处理，同样采用SDS-PAGE鉴定，结果显示：预期大小的条带主要出现在诱导菌的上清中，证明mTLNE为可溶性蛋白。 随后对mTLNE蛋白进行大量表达，用可溶性蛋白试剂盒纯化回收，并用SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA等方法鉴定纯化的蛋白，结果表明：获得了mTLNE蛋白，其纯度大于99%，并且mTLNE蛋白可与EV71病毒免疫的鼠血清和兔血清反应，说明重组蛋白mTLNE具有良好的抗原性。 3：重组蛋白mTLNE的免疫原性与免疫保护性分析； 将mTLNE蛋白免疫6周龄的BABL/c雌鼠(Trx蛋白为阴性对照)，每隔两周加强免疫一次，共免疫三次。采用ELISA的方法测定免疫血清的IgG效价及亚型，结果显示：mTLNE初次免疫后即能够诱导小鼠体内产生EV71病毒特异性的IgG抗体，且随着免疫的加强，IgG效价逐渐升高，第二次加强免疫之后，IgG效价可以达到1:3191，lgG分型显示mTLNE诱导小鼠产生的lgG亚型主要为IgG1。采用TCID50的方法进行中和滴度的测定，结果显示第二次加强免疫后，免疫血清的中和抗体效价可以达到1:50。采用ELISPOT的方法对脾细胞分泌的细胞因子进行测定。结果显示mTLNE免疫小鼠后诱导其体内产生的细胞因子以IL-4和IL-6为主。 随后又测定了免疫血清对1日龄BALB/c乳鼠的体内保护效果。结果显示：注射mTLNE免疫血清的小鼠全部存活且没有发病症状，而注射Trx免疫血清和PBS的小鼠在第5天开始发病，10天之内全部死亡，说明mTLNE的免疫血清可以有效的保护新生乳鼠免受EV71病毒的攻击。 本研究表明，在原核细胞中表达的EV71串联多表位疫苗mTLNE，可有效诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答，而且免疫血清能够被动保护乳鼠免受致死剂量的EV71攻击。表明该疫苗可作为一种潜在的EV71疫苗候选株，以上结果为研制EV71新型疫苗提供了新思路。
【关键词】：EV71疫苗 线性中和表位 保护
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词表7-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-20
• 第一部分 EV71 串联线性中和表位 mTLNE 的设计与构建20-29
• 1. 引言20-21
• 2. 材料和方法21-24
• 2.1 材料21
• 2.2 方法21-24
• 3. 结果24-27
• 3.1 mTLNE 原核表达载体的构建策略24-25
• 3.2 串联多表位基因的重叠 PCR 扩增25-26
• 3.3 PCR 产物和原核表达载体双酶切与连接26-27
• 3.4 重组质粒的鉴定27
• 4. 讨论27-29
• 第二部分 重组蛋白 mTLNE 的表达、纯化和鉴定29-40
• 1. 引言29
• 2. 材料和方法29-34
• 2.1 材料29-30
• 2.2 方法30-34
• 3. 结果34-39
• 3.1 mTLNE 和 Trx 蛋白的诱导表达及鉴定34-36
• 3.2 mTLNE 和 Trx 蛋白的纯化及鉴定36-39
• 4. 讨论39-40
• 第三部分 重组蛋白 mTLNE 的免疫原性与免疫保护性分析40-51
• 1. 引言40
• 2. 材料和方法40-45
• 2.1 材料40-41
• 2.2 方法41-45
• 3. 结果45-49
• 3.1 免疫血清的免疫反应性鉴定45-46
• 3.2 免疫血清 lgG 效价的测定46-47
• 3.3 免疫血清 lgG 亚型分析47
• 3.4 免疫小鼠体内细胞因子的测定47-48
• 3.5 免疫血清中和效价的测定48
• 3.6 免疫血清体内保护效果的测定48-49
• 4. 讨论49-51
• 结论51-52
• 参考文献52-58
• 附录58-60
• 在读期间撰写的论文60-61
• 个人简历61-62
• 致谢62-63
• 综述及参考文献63-72
• 参考文献68-72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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2 周亚萍;史伟峰;朱荫昌;曹利民;朱思梅;史梅;李坤;姜庆波;;肠道病毒71型外壳蛋白VP1的可溶性表达、纯化及活性鉴定[J];热带医学杂志;2011年09期

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4 李江;马永平;李世彬;贺志良;姜柯安;;重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达[J];中国微生态学杂志;2011年05期

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本文编号：397283