人精子赖氨酸乙酰化蛋白质组学研究

发布时间：2017-05-26 17:09

  本文关键词：人精子赖氨酸乙酰化蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蛋白质的赖氨酸乙酰化作为一种动态的可变修饰,逐渐成为重要的蛋白质翻译后修饰之一。在过去的50年里,对赖氨酸乙酰化的研究主要集中在组蛋白及其在转录调控中的作用。而对非组蛋白乙酰化的研究,在近十多年来才开始逐渐引起人们的重视。随着高通量蛋白质组学技术的发展,赖氨酸乙酰化在原核生物、酵母、植物、岗地弓形虫、果蝇、啮齿类以及人类细胞等均已进行了大量研究。正因此,一大批转录因子、细胞骨架蛋白、代谢酶等非组蛋白均被鉴定到为(去)乙酰化底物,并且发现大量的乙酰化非组蛋白广泛参与到中间代谢,调控糖酵解、三羧酸循环等多个代谢过程。然而,配子中非组蛋白赖氨酸乙酰化的组成及功能尚不得而知。 本实验室在前期的研究工作中引进了先进的轨道阱(Orbitrap)质谱仪,建立了比较成熟的蛋白质组学研究平台,并成功构建了人精子蛋白质谱系。在该谱系中,有大量去乙酰化酶被鉴定到。我们通过免疫印迹及免疫荧光等方法发现大量赖氨酸乙酰化蛋白可能存在于获能后的人精子中,而在生理状态下,只有获能后的人精子才能使卵子受孕。为能够尽可能多的获取获能后人精子的赖氨酸乙酰化蛋白相关数据,我们构建了成熟的赖氨酸乙酰化蛋白富集平台。我们通过用泛赖氨酸乙酰化抗体亲和富集乙酰化肽段并进一步用高通量的液相色谱-串联质谱联用的方法,经过两次生物学重复,在体外获能后的人精子中共鉴定到了1206个赖氨酸乙酰化位点,对应于576个赖氨酸乙酰化蛋白。生物信息学分析显示这些乙酰化蛋白广泛定位于线粒体(153个)、核质(25个)、鞭毛(21个)、胞质(13个)及质膜(8个)等,并在顶体囊泡和透明带受体复合物亦有一定程度富集,提示乙酰化可能与精子的运动、获能、顶体反应和精卵相互作用等多种功能相关。通过蛋白质相互作用关系网可发现多种乙酰化蛋白质参与的复合物如呼吸链复合物I、ATP合成酶复合物以及蛋白酶体复合物等。用赖氨酸去乙酰化酶抑制剂(制滴菌素和尼克酰胺)处理精子后,发现精子活力下降,提示乙酰化的变化可能影响精子的运动能力。用不同浓度泛赖氨酸乙酰化抗体进行小鼠体外受精抑制试验,统计学分析显示赖氨酸乙酰化抗体对体外受精率(2-细胞胚胎率)有浓度依赖性的抑制作用,这说明赖氨酸乙酰化对于受精可能有着重要作用。因此,赖氨酸乙酰化可能是调控精子功能的一种重要机制。 综上,我们构建了获能后人精子的赖氨酸乙酰化蛋白质谱系,发现了大量跟精子运动、受精等功能相关的赖氨酸乙酰化蛋白。这为以后进一步研究男性生育提供丰富的资源,同时也为研究男性不育的机制和诊断提供了可能的分子靶标。
【关键词】：乙酰化蛋白质组 获能 人精子 赖氨酸乙酰化 蛋白质组学
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321.1
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 实验材料与方法11-39
• 一.实验材料11-19
• 二.实验方法19-39
• 实验结果39-57
• 一、赖氨酸乙酰化抗体制备39-40
• 二、获能后精子的赖氨酸乙憸化蛋白的表达和定位40-43
• 三、构建获能后人精子赖氨酸乙憸化蛋白谱系43-45
• 四、鉴定到的赖l#酸乙酰化位点的验证45-48
• 五、人精子赖氨酸乙憸化蛋白的注释48-52
• 六、人精子活力评估52-55
• 七、小鼠体外受精（IVF)评估55-57
• 讨论57-62
• 1.结构蛋白58-59
• 2.能量代谢相关蛋白59
• 3.获能相关蛋白59-60
• 4.顶体反应相关蛋白60
• 5.精卵相互作用60-62
• 参考文献62-69
• 文献综述69-87
• 参考文献80-87
• 攻读学位期间发表文章情况87-88
• 致谢88

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