靶向性腺病毒介导的肿瘤自杀基因治疗的应用和甲基硒醇前药与MDV3100在去势抵抗型前列腺癌中联合应用的研究

发布时间：2024-05-30 01:27

　　1.靶向性腺病毒介导的肿瘤自杀基因治疗的应用 自杀基因疗法是将病毒或细菌的基因引入肿瘤细胞，利用该自杀基因编码的特异性酶将无毒性药物转化为对细胞有毒性的药物，杀死肿瘤细胞，这是一种有效的肿瘤基因治疗的方式。 影响自杀基因疗效的最关键问题就是选择一个合适的载体将自杀基因转导至靶细胞。复制缺陷型腺病毒血清型5(Ad5)是目前肿瘤基因治疗中应用最多的病毒载体。虽然Ad5载体显示了很好的基因转移能力，但细胞表面柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor, CAR)表达量的差异将严重影响病毒的转导效率，因为CAR是Ad5与细胞结合的关键位点，它介导病毒与细胞的结合及细胞对病毒的内吞作用。研究表明很多肿瘤细胞缺乏CAR，因此这将是以Ad5为载体的肿瘤基因治疗面临的一个重要问题。大量研究表明基因改造的方法可提高Ad5在缺乏CAR的肿瘤细胞中的病毒嗜向性，因此这也是一个有潜力的可提高肿瘤自杀基因治疗的策略。 研究表明暴露在knob外表面的HI-loop是一个加入外源氨基酸序列的良好位点，但是Ad5全基因组约36kb，很难直接向其中加入只编码几十个氨基酸的碱基序列...

【文章页数】：106 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
第一章 靶向性腺病毒介导的肿瘤自杀基因治疗的应用
    第一节 前言
        1.1 肿瘤的基因治疗
        1.2 自杀基因疗法
            1.2.1 自杀基因疗法
            1.2.2 自杀基因系统
            1.2.3 双自杀基因联合应用
        1.3 自杀基因治疗的载体
            1.3.1 基因治疗的载体
            1.3.2 腺病毒作为基因治疗载体
            1.3.3 腺病毒载体的靶向性改造
        1.4. 自杀基因表达的调控
            1.4.1 肿瘤特异性启动子
            1.4.2 端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)
    第二节 论文设计
        2.1 论文思路
            2.1.1 靶向性腺病毒载体
            2.1.2 双自杀基因联合应用
            2.1.3 肿瘤特异性启动子 hTERT 调控自杀基因的表达
        2.2 论文目的
        2.3 实验设计
            2.3.1 实验方案
            2.3.2 实验流程
    第三节 材料与方法
        3.1 实验材料
            3.1.1 细胞、质粒、病毒和动物
            3.1.2 主要试剂及抗体
            3.1.3 主要仪器
        3.2 实验方法
            3.2.1 靶向性腺病毒载体平台的构建及鉴定
            3.2.2 重组腺病毒的包装、扩增、纯化、定量及鉴定
        3.3 流式细胞仪检测 CAR 及整合素αvβ3 和αvβ5
        3.4 荧光素酶活性的检测
        3.5 靶向性双自杀基因及其前药在体外对肿瘤细胞生长的作用
        3.6 靶向性双自杀基因及其前药对于荷瘤鼠肿瘤生长的影响
        3.7 靶向性双自杀基因及其前药对于荷瘤裸鼠肝组织的影响
    第四节 结果与讨论
        4.1 靶向性 Ad5 载体平台的建立及靶向性腺病毒的获得
            4.1.1 Ad5 载体平台的建立
            4.1.2 穿梭质粒的构建
            4.1.3 腺病毒质粒 pAd-RGD-Luc 的构建及鉴定
            4.1.4 重组腺病毒的 Ad-Luc 和 Ad-RGD-Luc 的获得及鉴定
        4.2 靶向性腺病毒 AD-RGD-LUC 在 CAR-缺陷的肿瘤细胞中的作用
        4.3 携带双自杀基因的靶向腺病毒在肿瘤自杀基因治疗中的作用
            4.3.1 携带双自杀基因的靶向腺病毒的获得及鉴定
            4.3.2 携带双自杀基因的靶向性腺病毒在体外对肿瘤生长的抑制作用
            4.3.3 携带双自杀基因的靶向性腺病毒在体内抑制肿瘤生长
            4.3.4 携带双自杀基因的腺病毒对肝脏的影响
        4.4 小结
第二章 甲基硒醇前药与 MDV3100 在去势抵抗型前列腺癌中的联合应用
    第一节 背景知识
        1.1 前列腺癌
        1.1.1 前列腺癌的发病率
        1.1.2 前列腺癌的诊断
    1.2 雄激素与雄激素受体
        1.2.1 雄激素
        1.2.2 AR 的结构与功能
        1.2.3 雄激素信号通路
        1.2.4 非雄激素依赖的 AR 信号通路
        1.3 前列腺癌的激素治疗
        1.4 去势抵抗型前列腺癌(CRPC)
            1.4.1 CRPC 的发生及产生机制
            1.4.2 CRPC 的治疗
            1.4.3 靶向 AR 信号通路的新药
    第二节 论文设计
        2.1 论文思路
            2.1.1 MDV3100 对 CRPC 患者的治疗
            2.1.2 AR-Vs 对 MDV3100 的耐药性的产生
            2.1.3 甲基硒醇前药对前列腺癌的治疗作用
            2.1.4 甲基硒醇前药与 MDV3100 联合用药的可能性
        2.2 论文目的
        2.3 实验设计
            2.3.1 实验方案
            2.3.2 实验流程
    第三节 材料与方法
        3.1 实验材料、试剂及器材
            3.1.1 细胞和质粒
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要仪器
        3.2 实验方法
            3.2.1 实时定量 PCR (RT-PCR)
            3.2.2 核连缀转录检测 (Nuclear Run-on)
            3.2.3 报告基因检测
            3.2.4 细胞生长检测
            3.2.5 药物相互作用联合指数
            3.2.6 裸鼠 22Rv1 肿瘤模型及体内实验
            3.2.7 定量 ELISA 检测血清中 PSA
            3.2.8 薄层色谱
            3.2.9 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)
            3.2.10 AR N-末端和 C-末端二聚作用检测
            3.2.11 统计分析
    第四节 结果与讨论
        4.1 MSA 对 AR-FL 和 AR-Vs 的表达及活性的作用
            4.1.1 MSA 抑制 AR 基因的转录
            4.1.2 MSA 抑制 AR-Vs 蛋白和 mRNA 的表达
            4.1.3 MSA 对非雄激素依赖的 AR 活性的抑制作用
        4.2 MSA 和 MDV3100 在体外的联合作用
            4.2.1 MSA 增强 MDV3100 对 AR 信号通路的抑制作用
            4.2.2 MSA 增强 MDV3100 对肿瘤细胞生长的抑制作用
            4.2.3 下调 AR-FL 和 AR-VS 是联合给药抑制肿瘤细胞生长的重要作用机制
        4.3 MSC 和 MDV3100 在荷瘤裸鼠体内的联合作用
            4.3.1 联合给药抑制肿瘤细胞生长
            4.3.2 联合给药抑制血清中 PSA 浓度
            4.3.3 联合给药抑制瘤内 AR-FL 及 AR-Vs 蛋白的表达
            4.3.4 MDV3100 与 MSA 的化合反应
        4.4 MDV3100 对 AR 二聚作用的影响
            4.4.1 MDV3100 在体内和体外均下调 AR-FL 的表达
            4.4.2 MDV3100 抑制 AR 的二聚作用
        4.5 小结
结论
参考文献
作者简历
致谢



本文编号：3984372