轮状病毒NSP5真核表达载体的构建、鉴定及功能研究

发布时间：2024-06-02 08:32

　　研究轮状病毒(Rotavirus,RV)非结构蛋白5(NSP5)在体外对RV复制的作用。以质粒pEGFP-N2为载体构建出可特异性表达重组蛋白NSP5的真核表达载体后,将重组质粒转染MA104细胞并分别通过免疫荧光和Western Blot检测NSP5在转染后不同时间的表达差异。随后,重组质粒转染组及对照组细胞分别接种相同剂量的RV,一定时间后根据GFP分布来确认重组蛋白NSP5在细胞内的迁移变化情况,并比较实验组和对照组之间的RV复制能力差异。结果发现,NSP5蛋白在重组质粒转染细胞48 h后表达达到顶峰。此外,GFP也显示NSP5蛋白随RV的感染从弥散状转变为点状聚集,且转染该重组质粒的细胞内RV复制水平明显高于对照细胞。说明了轮状病毒NSP5对病毒的复制具有明显促进作用,这也为深入了解RV的感染、复制及致病机理提供理论基础。

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

图1pEGFP-N2-NSP5重组质粒构建流程

挑取培养板中长势良好的单克隆菌落至中管(Kana:50μg/mL)扩大培养后提取重组质粒,并对其进行双酶切、PCR及测序鉴定。特异表达重组蛋白NSP5的重组质粒命名为pEGFP-N2-NSP5,构建过程如图1。1.2.4pEGFP-N2-NSP5的真核细胞转染及其表达水平检测

图2重组质粒构建及鉴定的电泳结果

重组质粒pEGFP-N2-NSP5转染MA104细胞后,分别于转染24、36、48和72h后取出细胞做免疫荧光,并于倒置荧光显微镜下观察特异性标记红色荧光的重组蛋白NSP5在细胞内的分布及表达量与时间的关系。结果显示,重组蛋白NSP5在MA104细胞的胞质和胞核中均有分布且主要....

图3免疫荧光和WesternBlot鉴定pEGFP-N2-NSP5的NSP5蛋白表达

图2重组质粒构建及鉴定的电泳结果2.3瞬时转染pEGFP-N2-NSP5对RV复制的影响

图4pEGFP-N2-NSP5对RV复制影响的检测结果

以RV标准毒株One-StepProbeqRT-PCR的Cq值为Y轴、标准毒株浓度以10为底的对数为X轴建立标准曲线(图4-a):Y=-4.8205x+49.434,R2=0.9922。将RV样品Cq值带入标曲后可求出对应的RV拷贝浓度。3组不同处理的MA104细胞接种等量R....

本文编号：3987089