重组SALL4B蛋白的表达及功能分析

发布时间：2017-05-27 13:02

  本文关键词：重组SALL4B蛋白的表达及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：利用昆虫杆状病毒表达系统大规模表达并纯化转录因子SALL4B蛋白,并对纯化后的SALL4B蛋白的生物活性进行验证。 方法及结果：SALL4是具有锌指结构的细胞转录因子。SALL4在干细胞多能性的维持及自我更新方面具有关键作用,并能够有效的促进造血干细胞扩增,该蛋白在体内主要有SALL4A及SALL4B两种亚型。本实验通过构建连接有穿膜肽TAT、6个组氨酸及人SALL4B基因的重组杆状病毒,并使用该重组病毒感染高密度的Sf9(Spodoptera frugiperda,草地贪夜蛾)昆虫细胞。通过SDS-PAGE及Western blot验证,目的蛋白TAT-SALL4B可溶性表达于Sf9昆虫细胞内。由于重组蛋白具有6xHis标签,故后续利用Ni离子在非变性条件下进行亲和层析纯化获得纯度较高的目的蛋白。为初步测试纯化后TAT-SALL4B的生物活性,100nM及500nM的TAT-SALL4B蛋白被直接添加入铺有HeLa细胞的培养液中,孵育1.5小时或8小时后进行细胞免疫荧光染色以验证该蛋白转导进入细胞的能力。荧光显微镜显示,重组TAT-SALL4B能够进入细胞并定位于细胞核,其信号强度与添加的目的蛋白浓度和孵育时间正向相关。为了进一步测试TAT-SALL4B蛋白的转录活性,进行了双荧光素酶报告基因分析,结果表明加入10nM以上浓度的TAT-SALL4B蛋白即能够有效激活OCT4启动子并启动下游基因的表达。 结论：本实验建立了利用昆虫杆状病毒表达系统高效表达TAT-SALL4B蛋白的体系,并通过在非变性条件下进行镍离子亲和层析而达到高效纯化的目的。后续功能验证的结果显示TAT-SALL4B够在TAT的介导下有效穿膜,并定位于细胞核。同时,纯化后的TAT-SALL4B蛋白能够激活OCT4启动子,具有转录活性。本实验为今后利用SALL4B蛋白在体外扩增造血干细胞并运用于干细胞移植手术提供了一个有效的平台。
【关键词】：杆状病毒表达系统 蛋白纯化 报告基因 TAT-SALL4B 转录活性
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 前言6-9
• 实验材料及方法9-16
• 1. 实验材料9-11
• 2. 实验方法11-16
• 结果与分析16-26
• 3.1 重组TAT-SALLAB蛋白诱导表达及鉴定16-20
• 3.2 重组TAT-SALLAB蛋白诱导表达及纯化条件的优化20-22
• 3.3 重组TAT-SALLAB蛋白的细胞转导实验22-24
• 3.4 重组TAT-SALL4B蛋白双荧光素酶报告基因分析24-26
• 讨论26-28
• 参考文献28-31
• 论文综述31-46
• 参考文献40-46
• 附录46-59
• 致谢59-61
• 研究生简历61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 乔永萍;任磊;王林;王祖勇;张其清;;穿膜肽Tat以脂筏介导的巨胞饮方式进入骨髓间充质干细胞[J];厦门大学学报(自然科学版);2008年02期

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本文编号：399998