抗人D-二聚体单克隆抗体的制备及应用初探

发布时间：2017-05-27 15:00

  本文关键词：抗人D-二聚体单克隆抗体的制备及应用初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：从人交联纤维蛋白降解产物(FDP)中纯化D-二聚体(D-dimer),并以人D-二聚体为抗原制该蛋白质的单克隆抗体(McAb),在对其相关性质进行鉴定的基础上,初步探索抗D-二聚体单克隆抗体(D-dimer McAb)的应用。方法：1.利用人纤维蛋白原、凝血酶、凝血因子XⅢ、纤溶酶制备人交联纤维蛋白降解产物(FDP);2.采用Sephacryl S-300层析过滤和PBE94聚焦层析两步法从FDP中分离纯化D-dimer;3.用纯化的D-dimer免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立可分泌D-dimer McAb的杂交瘤细胞株,并对其进行核染色体分析,同时使用间接EL ISA法检测杂交瘤细胞株持续稳定分泌抗体的能力。选取8株细胞株,采用体内诱生腹水法制备腹水,并用半饱和硫酸铵沉淀法和DEAE affi-gel blue层析法分离纯化腹水中的D-dimer McAb;4.采用SDS-PAGE电泳鉴定抗体的纯度；琼脂糖免疫双向扩散实验鉴定D-dimer McAb的亚类；ELISA相加实验确定D-dimer McAb识别的抗原表位；间接ELISA法检测D-dimer McAb的特异性,包括检测其是否与D-片段、E-片段、纤维蛋白原、凝血酶和FXⅢ有交叉反应和与D-dimer标准品的反应情况；间接ELISA检测D-dimer McAb的相对亲和力及五种二价金属离子对抗原抗体结合的影响。5.分别将03、05、07号D-dimer McAb与表面包被羧基基团的聚苯乙烯乳胶微粒进行偶联,检测其偶联效果。并将偶联好的微粒与D-dimer混合,进行抗原抗体结合反应,检测其反应效果。结果：1.经两步层析纯化,D-dimer的回收率为(27.27±6.35)%,D-dimer/总蛋白含量比为(77.82±7.98)%(n=3)。2.成功建立了8株能分泌D-dimer McAb的杂交瘤细胞株,分别编号为01～08,其核染色体平均数为86-93。建立的8株杂交瘤细胞株已连续5个月稳定分泌抗体。3.8株D-dimer McAb的性质鉴定结果如下：所有抗体的亚型都是IgG2b;除02、08号D-dimer McAb外,01、03、04、05、06、07号D-dimer McAb与D-dimer标准品都有较高的反应性；8株D-dimer McAb与D-片段、E-片段,纤维蛋白原、凝血酶和FXⅢ无交叉反应；8株D-dimer McAb分别识别同一抗原表位或者识别的抗原表位在空间上较为接近；8株D-dimer McAb与抗原的相对亲和力顺序为0307≥0504≥01≥02≥0608；Zn2+能有效抑制01～08号D-dimer McAb与抗原的结合,Mn2+对06、07号D-dimer McAb与抗原的结合有抑制作用,但抑制效果较Zn2+弱。4. D-dimer McAb偶联聚苯乙烯乳胶微粒的效果较好,但各株细胞的固定化率和特异性不一,03号抗体的偶联率为52.16%、05号为29.80%、07号为77.41%。偶联上抗体的聚苯乙烯乳胶微粒与D-dimer结合后,离心上清液在280nm处的吸光度平均下降59.54%。结论：本实验所设计的两步层析法能有效地分离纯化D-dimer,且纯化的D-dimer能诱使BALB/c小鼠产生较高的免疫反应；成功建立了8株能分泌D-dimer McAb的杂交瘤细胞株；利用D-dimer McAb偶联聚苯乙烯乳胶微粒,偶联的微粒可以和D-dimer结合,为后续D-dimer检测试剂盒的开发打下了物质和技术基础。
【关键词】：D-二聚体 单克隆抗体 制备 应用
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

  本文关键词：抗人D-二聚体单克隆抗体的制备及应用初探，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：400285