羊口疮病毒编码的一种新型NF-κB核抑制剂002蛋白的分子机制

发布时间：2017-05-27 16:09

  本文关键词：羊口疮病毒编码的一种新型NF-κB核抑制剂002蛋白的分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：羊口疮又称羊传染性脓疱病或羊传染性脓疱性皮炎,是由羊口疮病毒(ORFV)引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性传染病。羊口疮病毒通常侵袭患羊的唇部、鼻孔周围和乳头等破损处皮肤和粘膜,形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状痂皮,主要引起皮肤和黏膜的增生性病变。该病的感染率高达80~89%,死亡率达5~6%,幼龄羔羊的死亡率可达93%。羊口疮在世界各地均有发生,尤其是养羊较多的地区,可造成巨大的经济损失。 ORFV为双链DNA病毒,属于痘病毒科,脊椎动物痘病毒亚科,副痘病毒属。这个属的其他成员还包括小牛侵蚀性口炎病毒(bovine papular stomatitis virus, BPSV)和伪牛痘病毒(pseudocowpox virus, PCPV)等。电镜下,ORFV为椭圆形,大小260~300nm×160~190nm,特征形态为椭圆颗粒外包绕相互交错的小管,呈线团样结构。ORFV基因组全长约140kbp,至少含有132个预测基因。 研究表明,羊口疮病毒的许多编码蛋白可以调节机体的免疫反应过程。这些蛋白包括病毒IL-10同源蛋白(ORFV127)、趋化因子结合蛋白(ORFV112)、粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子和IL-2抑制蛋白(ORFV117)、血管内皮生长因子(ORFV132)、干扰素抗性蛋白(ORFV020)、BCL-2样蛋白(ORFV125)以及NF-κB信号通路抑制蛋白(ORFV024, ORFV002, ORFV121)[4]。 本研究小组的前期研究发现ORFV002是一种病毒晚期基因,蛋白合成后定位于细胞核内,在细胞核内抑制NF-κB途径。但是ORFV002发挥作用的具体机制尚不明确,仍然有待进一步研究。因此本研究的目的在于阐明ORFV002抑制p300与p65相互作用的机制,明确ORFV002发挥生物学功能的结构域以及寻找宿主内与ORFV002相互作用的其他蛋白。 为了明确ORFV002可能的作用区域,构建了四个缺失各个结构域的重组载体,分别是ORFV002GFP M1(△结构域1)、ORFV002M2(△结构域1和2)、ORFV002M3(△结构域3)、ORFV002M4(△结构域2和3),用以鉴定002蛋白的功能性结构域,将这些突变体构建于含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体中,并都在正确位置获得表达。 利用激光共聚焦显微镜观察了ORFV002及其突变体的细胞内的定位情况。结果表明,ORFV002定位于细胞核,而蛋白在细胞中的定位与其功能是息息相关的。融合表达了GFP标签的ORFV002定位在细胞核内;保留了N端序列的002突变体,GM3和GM4与野生型ORFV002定位一致,荧光信号也在细胞核内；而缺失了N端序列的突变体002GM1, GM2的荧光信号则与对照GFP蛋白一样,是定位在细胞质中的。研究结果初步提示ORFV002蛋白的N端,尤其是CR1区对于该蛋白在细胞中的定位以及功能的发挥是非常重要的。 进一步观察ORFV002蛋白及其各突变体对NF-κB转录活性的影响,采用双荧光素酶报告基因检测试验盒测定002及其各突变体转染细胞后NF-κB转录活性。野生型002,002GM3和002GM4能够显著降低NF-κB p65的转录活性,荧光素酶活性增强不明显,而002GM1,002GM2和GFP则对NF-κB p65没有抑制作用,NF-α和LPS刺激引起荧光素酶活性显著增强。这一结果与共聚焦定位的结果一致,提示ORFV002的N端序列是决定该蛋白功能的主要区域。 ORFV002通过抑制NF-κB-p65第310位赖氨酸(Lys)的乙酰化来发挥作用。利用Western blot验证了002及其各突变体对NF-κB-p65乙酰化的影响。表达野生型的002及包含002N端序列的突变体GM3,GM4蛋白的细胞中,NF-κB-P65第310位赖氨酸乙酰化水平明显减弱,表明这些蛋白的表达能够抑制p65Lys310的乙酰化。相反,表达突变体002GM1(缺失了N端52个氨基酸)和002GM2(缺失N端94个氨基酸)和GFP的细胞中,p65Lys310的乙酰化仍处于较高水平。p65蛋白生成后,要经过一系列严密的磷酸化、乙酰化修饰调控,才能保证下游基因的正确表达。其中Ser276这个磷酸化位点是p65中相当保守的一个磷酸化位点。在细胞核中,Ser276磷酸化会导致p65汇集转录共激活因子p300/CBP, p300/CBP乙酰化Lys310,然后才能调控下游基因的表达。鉴于002能够干扰p65和p300的结合,因此提出假设：ORFV002通过影响p65Ser276的磷酸化,从而阻断了p65的转录活性。接下来,我们通过Western blot实验对ORFV002能否抑制p65Ser276的磷酸化进行了验证。Western blot结果表明ORFV002及其含有N端序列的突变载体在OFTu中的表达使得p65Ser276的磷酸化水平明显下降。这正和我们的假设一致,即002抑制了p65Ser276的磷酸化。p65进入细胞核后,在p38和MKK6的协助下,由MSK1来磷酸化p65Ser276这一位点,磷酸化后的p65能汇集共刺激因子CBP/P300,从而使得下游转录被激活。ORFV002正是作用于这一位点,使得MSK1磷酸化过程被抑制。 为了进一步了解ORFV002在细胞内的其它功能,利用酵母双杂交技术来鉴定与ORFV002的互作的蛋白。将ORFV002构建到载体pGBKT7中作诱饵,把羊胚胎鼻甲细胞cDNA构建到载体pGADT7中作文库,通过筛选cDNA文库,一共获得了25个在酵母内与002相互作用的阳性克隆。对其测序结果利用BLASTn对其验证和比对,结果证实25个阳性克隆分别编码3种不同的蛋白,其中22个为钙结合蛋白S100A4。以免疫荧光、GST pull down和免疫共沉淀技术对S100A4与ORFV002的相互作用做进一步验证。实验结果表明S100A4与ORFV002在体内和体外均存在相互作用。 通过以上研究,对ORFV002抑制NF-κB的分子作用机制进行了鉴定。ORFV002通过其N端功能结构域抑制MSK1介导的NF-κB p65Ser276的磷酸化,从而抑制了NF-κB的转录活性,研究还发现ORFV002和S100A4存在相互作用。研究结果对进一步确定NF-κB信号途径对病毒感染的反应,以及识别该途径中的关键环节,有助于开发针对该位点的潜在治疗药物。
【关键词】：羊口疮病毒 羊口疮病毒002蛋白 核因子κB信号通路 酵母双杂交
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373;R3416
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-18
• 第一部分 ORFV002 N端抑制NF-κB p65 Ser~(276)磷酸化18-41
• 1 材料18-20
• 2 方法20-28
• 3 结果28-40
• 4 小结40-41
• 第二部分 发现与鉴定ORFV002与S100A4相互作用41-58
• 1 材料41-44
• 2 方法44-51
• 3 结果51-57
• 4 小结57-58
• 讨论58-62
• 参考文献62-67
• 致谢67-68

【参考文献】

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1 Yong-Gu Cho;Chang-Jae Kim;Suk-Woo Nam;Shin-Hee Yoon;Sug-Hyung Lee;Nam-Jin Yoo;Jung-Young Lee;Won-Sang Park;;Overexpression of S100A4 is closely associated with progression of colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2005年31期

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本文编号：400480