核仁素在血管新生中的作用及其机制初步探讨

发布时间：2017-05-28 07:03

  本文关键词：核仁素在血管新生中的作用及其机制初步探讨，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：摘要：血管新生是一个复杂的生物学过程,但其具体机制目前尚未完全明了。核仁素是一种具有多种生物学功能,在真核生物中高度保守的核仁磷酸蛋白,也是一种重要的RNA结合蛋白,具有在核仁、胞核、胞浆,甚至细胞膜表面穿梭的特性。大量研究表明,细胞膜表面核仁素参与血管新生的调节。然而,核仁素的RNA结合特性在血管新生中有何作用,目前仍不清楚。本研究在明确核仁素对血管新生起调节作用后,拟初步探讨其RNA结合特性在血管新生中的作用及其可能的机制。 本实验首先通过建立小鼠心肌缺血模型,利用免疫组化和免疫荧光技术观察血管新生和核仁素的表达,并采用PCR和Western Blot技术检测血管新生相关基因和核仁素的表达。其次,在细胞水平,建立VEGF诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)发生细胞迁移和管型形成的模型,采用增加和降低核仁素表达的研究手段,探讨核仁素在VEGF诱导内皮细胞迁移和管型形成中的作用；同时利用PCR和Western Blot技术观察血管新生相关基因的表达情况。最后利用蛋白质-RNA免疫共沉淀技术探讨血管新生中核仁素可能调控的相关靶基因,以阐明核仁素在血管新生中发挥作用的可能机制。 主要实验结果如下： 1.整体动物实验。 (1)免疫组化和免疫荧光分析发现：心肌缺血后15天,缺血组心肌组织中核仁素和血管内皮钙粘蛋白表达升高,与假手术组比,具有统计学意义。 (2)PCR和Western Blot技术检测显示：缺血组心肌组织中核仁素和血管新生相关基因表达升高,与假手术组比,差异具有统计学意义。 (3)HE染色显示核仁素转基因小鼠血管密度明显增高,免疫组化、PCR和Western Blot技术检测显示血管新生相关基因表达升高,与野生型小鼠相比,差异具有统计学意义。 2.细胞实验。 (1)PCR和Western Blot技术检测显示VEGF可诱导HUVEC核仁素表达升高,并在一定程度上呈时间和浓度依赖性。 (2)核仁素过表达能促进VEGF诱导的HUVEC发生细胞迁移和管型形成；反之,siRNA介导的核仁素低表达则能抑制VEGF诱导的HUVEC发生细胞迁移和管型形成。 (3)生物信息学分析显示多个血管新生相关基因如VE-cadherin, Tie-2, MMP9, Endoglin, COX43等的mRNA含有一个或多个核仁素的结合元件。 (4)PCR和Western Blot技术检测显示siRNA介导的核仁素低表达能抑制血管新生相关基因的表达。 (5)利用蛋白质-RNA免疫沉淀技术,发现核仁素与血管新生相关基因MMP9, Endoglin, integrin a V有相互作用。 本实验可得出如下结论： 1.C23能促进血管新生。 2.C23的RNA结合特性可能参与了VEGF介导的血管新生。
【关键词】：核仁素 血管新生 血管内皮生长因子 管型形成 内皮细胞钙粘蛋白
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 符号说明12-13
• 1 前言13-15
• 2 材料与方法15-22
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 实验动物,实验细胞15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.1.2.1 抗体15
• 2.1.2.2 其他主要试剂15-16
• 2.1.3 引物序列16-17
• 2.1.4 主要仪器17
• 2.2 方法17-22
• 2.2.1 动物饲养与实验分组17-18
• 2.2.2 小鼠心肌缺血模型的制备18
• 2.2.3 心肌组织、HUVEC总蛋白的提取和蛋白表达的免疫印迹分析18
• 2.2.4 心肌组织、HUVEC总RNA的提取,逆转录和PCR分析18-19
• 2.2.5 HE染色、免疫组化染色和免疫荧光染色19-20
• 2.2.6 细胞培养20
• 2.2.7 C23真核表达质粒20
• 2.2.8 C23反义寡核苷酸的构建20
• 2.2.9 细胞瞬时转染20
• 2.2.10 细胞迁移实验20-21
• 2.2.11 管型形成实验21
• 2.2.12 蛋白质-RNA免疫沉淀21
• 2.2.13 统计分析21-22
• 3 实验结果22-43
• 3.1 小鼠心肌缺血时C23的表达和血管新生的变化22-28
• 3.1.1 小鼠心肌缺血时C23的表达变化22-24
• 3.1.2 小鼠心肌缺血时血管新生的变化24-28
• 3.2 心肌特异性高表达C23的转基因小鼠血管新生的变化28-33
• 3.3 C23高表达和低表达对血管新生的影响33-40
• 3.3.1 VEGF诱导HUVEC C23蛋白的变化33-34
• 3.3.2 VEGF诱导HUVEC中C23 mRNA的变化34-35
• 3.3.3 C23过表达和低表达对VEGF介导的HUVEC细胞迁移能力的影响35-36
• 3.3.4 C23过表达和低表达对VEGF介导的HUVEC细胞迁移的影响36-37
• 3.3.5 C23过表达和低表达对VEGF介导的HUVEC管型形成的影响37-39
• 3.3.6 C23低表达对VEGF介导的HUVEC中血管新生相关基因mRNA表达的影响39-40
• 3.4 生物信息学分析40-41
• 3.5 C23蛋白与血管新生相关基因mRNA的相互关系41-43
• 4 讨论43-45
• 5 结论45-46
• 参考文献46-50
• 综述50-64
• 参考文献58-64
• 攻读学位期间主要的研究成果目录64-65
• 致谢65

【共引文献】

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本文编号：402101