梅毒螺旋体膜蛋白TprF抗原表位的预测与鉴定

发布时间：2017-05-28 08:05

  本文关键词：梅毒螺旋体膜蛋白TprF抗原表位的预测与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：筛选和鉴定梅毒螺旋体(Treponema pallidum, Tp)膜蛋白TprF的B细胞表位、Th细胞表位和联合Th-B细胞表位，，为深入研究Tp菌影多价表位疫苗提供实验依据和基础。 方法： (1) TprF抗原表位预测：从Genbank获取TprF的序列，采用SignalP4.0、TMHMM2.0等软件预测其信号肽和跨膜区；以IEDB、HLAPrep、SYFPEITHI等软件综合预测外膜蛋白TprF21-284aa的MHC-II类限制性Th细胞表位；运用IEDB和Mobyle等在线软件分析TprF，得到其编码蛋白的物理和化学特性如亲水性、可及性、易屈性及抗原性等，并由此评估TprF的B细胞表位；联合B-Th细胞表位为上述方法预测表位的重叠区。 (2) TprF预测表位合成与鉴定：委托北京泽溪源生物科技股份有限公司人工合成，表位多肽经反相高效液相色谱纯化，由质谱分析鉴定。 (3)重组TprF21-284aa表达与免疫反应性鉴定：构建pET30a(+)/TprF21-284aa的原核表达重组载体，转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)后经菌液PCR、测序和双酶切鉴定；SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法（WB）对表达产物进行分析和鉴定；亲和层析法纯化，BCA法测定蛋白浓度。 (4)重组TprF21-284aa免疫原性鉴定：新西兰兔用重组TprF21-284aa免疫5次，分别收集每次免疫血清，测定重组蛋白抗体效价；末次免疫后10天，处死兔子，分离脾细胞用于Th细胞表位的鉴定。 (5) TprF的B细胞表位鉴定：分别将合成的B/B-Th表位多肽和重组TprF作为抗原包被在酶标板上，以免疫兔血清和梅毒患者病人血清为一抗（同时设立阴性对照孔）以间接ELISA法鉴定TprF的B/B-Th表位。 (6) TprF的T细胞表位鉴定：阴性对照组为PBS，阳性对照组为ConA和重组TprF21-284aa全蛋白，实验组为合成的T/Th-B表位多肽，分别刺激培养免疫兔脾细胞，CCK-8法检测刺激其增殖水平，鉴定TprF中预测的Th细胞表位。 结果： (1)综合分析在线软件方案，预测TprF的候选B细胞表位为B1(43-62AA)、B2（89-103AA）、B3（231-251AA）；候选Th细胞表位为T1（81-88AA）、T2（132-146AA）、T3（183-198AA）；候选联合Th-B表位为L1（57-71AA）、L2（125-138AA）、L3（268-279AA）。 (2)合成多肽纯度均大于90%；质谱分析合成多肽分子量测定值与理论值一致。 (3)经PCR、双酶切及测序鉴定，插入片段为目的基因；SDS-PAGE结果显示，重组蛋白约36kDa大小，目的蛋白在表达菌中能够以可溶性蛋白形式表达；Western blot检测结果显示，重组蛋白与anti-His抗体、梅毒阳性病人血清、兔免疫血清产生特异性反应；ELISA检测TprF21-284aa抗体效价均在1:12000以上。 (4) ELISA结果显示，预测表位B1、T1与兔免疫血清、梅毒患者血清均呈阳性反应，而与健康动物（人和兔）、钩体病人血清均不反应。 (5) CCK-8法检测结果表明，预测多肽刺激的兔脾细胞无明显增殖。 结论： (1)原核表达载体pET30a-TprF21-284aa成功构建并表达，该重组蛋白具有良好的免疫原性与抗原性； (2)预测的表位B1、T1可能为TprF蛋白B细胞表位； (3)预测的表位T1、T2、T3、L1、L2、L3可能不是兔MHC分子提呈的TprF蛋白Th细胞表位。
【关键词】：梅毒螺旋体 TprF 膜蛋白 抗原表位 疫苗
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R377.1
【目录】：

• 主要中英文缩写4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 实验材料13-16
• 实验方法16-27
• 实验结果27-40
• 讨论40-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 附录48-52
• 综述52-61
• 参考文献57-61
• 在读期间科研成果61-62
• 致谢62

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本文编号：402198