人可溶性CD105蛋白的真核表达及纯化

发布时间：2025-01-06 05:47

　　 目的建立一种简便、高效的人可溶性CD105(soluble CD105,sCD105)蛋白的真核表达及纯化方法。方法人工合成胞外区和信号肽区域的DNA片段,在其信号肽前端加入Kozak sequence(GCACCATGG)序列,促进蛋白表达,同时在其C-末端6×His前加入K(AAG)氨基酸,促进6×His的暴露有助于后期纯化,构建真核表达质粒pcDNA3. 4-sCD105。通过瞬时转染的方法将重组质粒转染293F悬浮细胞,收集细胞上清液,利用His-trap EXCEL柱通过两步纯化法进行纯化。将纯化获得的sCD105蛋白超滤浓缩后,进行10%SDS-PAGE、Western blot及ELISA检测。结果在20 mL(1×10～6个/mL)293F悬浮细胞中表达及纯化后,获得纯度> 95%的sCD105蛋白3 mL,浓度为27. 83 mg/L,获得率高达4. 17 mg/L。结论成功建立了一种简便高效的sCD105蛋白表达及纯化的方法,为后期蛋白功能的研究及相应治疗或诊断性抗体的开发奠定了基础。

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 质粒及细胞
    1.2 主要试剂及仪器
    1.3 真核表达载体的构建
    1.4 质粒的大量提取
    1.5 293F细胞的转染
    1.6 蛋白的纯化
    1.7 蛋白含量的检测
    1.8 蛋白的鉴定
2 结果
    2.1 真核表达载体的鉴定
    2.2 转染细胞的细胞活性
    2.3 s CD105蛋白两步纯化产物的鉴定
    2.4 浓缩后的s CD105蛋白的鉴定
3 讨论



本文编号：4023883