香菇C91-3菌LP1-PI3K样蛋白的克隆表达、分离纯化及其活性研究
发布时间：2017-05-28 23:10
本文关键词：香菇C91-3菌LP1-PI3K样蛋白的克隆表达、分离纯化及其活性研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的： 构建高效快速且方便的His标签原核表达体系，对香菇C91-3菌自噬相关基因LP1-PI3K (Latcripin-1-PI3K)进行克隆，将成功克隆的质粒pET-32a-PI3K在E.coliRosetta-gami(DE3)中进行诱导表达，并对该LP1-PI3K样蛋白进行分离、纯化和复性。将纯化复性后的目的蛋白作用于人肺癌A549细胞，通过对其生物学活性的检测，初步分析其作用于肿瘤细胞的途径和机制，为LP1-PI3K样蛋白更进一步的生物学功能与作用机制的研究奠定基础，也为进一步深入揭示香菇C91-3菌的抗肿瘤机制及生物抗肿瘤药物的研究提供依据。 方法： 1.根据GenBank: JQ327159.1中香菇C91-3菌相关蛋白LP1(Latcripin-1)的基因序列，分别设计特异性上下游引物，采用PCR方法，以LP1基因序列为模板，扩增出LP1-PI3K基因结构域序列。将LP1-PI3K基因克隆到pMD19-T SimpleVector克隆载体中，进行蓝白斑筛选，挑选出阳性菌落，提取质粒经双酶切及PCR验证后，进行基因测序。再将纯化回收后的LP1-PI3K基因克隆到pET-32a原核表达载体中，构建重组质粒。将其转化入E.coli Rosetta-gami(DE3)，提取质粒，进一步经双酶切和特异引物PCR进行验证后，测序鉴定重组质粒。 2.将鉴定正确的含目的基因的原核表达载体在E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达。12%SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达情况，并且用Western-blot进行验证。采用亲和层析的方法分离纯化LP1-PI3K样蛋白，并对该蛋白进行尿素梯度复性，最后测定纯化后LP1-PI3K样蛋白浓度。 3.将已鉴定的各浓度的诱导表达蛋白作用于人肺癌A549细胞。用MTT(Methyl Thiazoly Ltetrazolium assay，MTT)法测定LP1-PI3K样蛋白对肿瘤细胞的抑制率；用流式细胞仪检测LP1-PI3K样蛋白对人肺癌A549细胞的凋亡作用及对人肺癌A549细胞周期的影响；用电镜法观察LP1-PI3K样蛋白作用于人肺癌A549肿瘤细胞后，肿瘤细胞形态学的变化；用Western-blot检测自噬体标记物LC3（微管相关蛋白1轻链3），根据LC3-I和LC3-II表达的变化，分析LP1-PI3K样蛋白诱导细胞自噬的水平。 结果： 1. PCR扩增出大小为747bp的基因片段，测序比对结果显示与GenBank上LP1基因序列中PI3K样结构域序列的同源性为100%，并成功构建了pET-32a原核表达载体。 2.此结构域蛋白在E.coli Rosetta-gami(DE3)中被大量诱导表达，12%SDS-PAGE电泳显示，蛋白分子质量大约为44KDa(计算载体标签后的蛋白相对分子量)。诱导表达过程中，目的蛋白在加入诱导剂后开始表达，3小时效率最高。Western-blot结果显示E.coli Rosetta-gami(DE3)所表达的蛋白为LP1-PI3K样蛋白。通过组氨酸标签亲和层析分离和纯化该蛋白，12%SDS-PAGE显示得到纯化的LP1-PI3K样蛋白。 3.对LP1-PI3K样蛋白生物学活性的初步检测：①对于人肺癌A549细胞，LP1-PI3K样蛋白作用浓度为分别为15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml，作用时间分别为24小时、48小时、72小时。当浓度为15μg/ml时抑瘤率分别为3.10%，8.22%，15.33%；当浓度为30μg/ml时抑瘤率分别为7.85%，14.36%，，19.70%；当浓度为60μg/ml时抑瘤率分别14.15%，29.49%，31.48%。MTT法检测结果：随着作用时间的延长和浓度的增加，抑瘤率逐渐增加。除15μg/ml的LP1-PI3K样蛋白作用24小时与对照组相比无统计学意义外，其余各组与对照组相比有显著性差异(P㩳0.05)。MTT实验结果说明LP1-PI3K样蛋白对人肺癌A549细胞有显著地抑制作用。②流式细胞仪检测结果显示，LP1-PI3K样蛋白具有一定诱导人肺癌A549细胞凋亡的能力，其作用可能与自噬相关。终浓度为30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml的此蛋白作用于人肺癌A549细胞48小时后，最大早期细胞凋亡率为8.49%，18.58%，20.45%；最大晚期细胞凋亡率为5.01%，10.06%，14.88%。细胞周期检测结果显示，实验组人肺癌A549细胞，在LP1-PI3K样蛋白作用下各期细胞较空白对照组相比S期变化不大，G1期G2/M期虽有变化，但该变化没有呈现出规律性。此外在G1期峰前还出现凋亡峰，但该凋亡峰没有表现出明显的浓度依赖性。③透射电子显微镜显示，60μg/ml LP1-PI3K样蛋白作用于人肺癌A549细胞48小时后，其形态学发生很大改变。对照组人肺癌A549细胞，膜相结构完整，细胞形态规整，线粒体丰富；目的蛋白作用组细胞：核染色质固缩，核碎裂，胞浆内空泡增多，出现凋亡小体，尤其在较大范围细胞中出现了大量的自噬小体，自噬体的出现是LP1-PI3K样蛋白作用于人肺癌A549的特征现象。④Western-blot检测LC3。在对照组中两种LC3自噬标记物：LC3-I和LC3-II的数量均较低。而将LP1-PI3K样蛋白60μg/ml作用于人肺癌A549细胞48小时后，从Western-blot的结果分析LC3-I和LC3-II的表达量均高于空白对照组，且LC3-II的表达明显高于LC3-I，说明LP1-PI3K样蛋白能诱导人肺癌A549细胞自噬体的产生。 结论： 1.本实验成功获得了LP1-PI3K样结构域序列，并成功构建了pET-32a原核表达体系。 2.本实验成功在E.coli Rosetta-gami(DE3)宿主菌中诱导表达出LP1-PI3K样蛋白；该蛋白经组氨酸标签亲和层析柱成功纯化；尿素梯度复性成功。 3. LP1-PI3K样蛋白生物学功能经初步研究，其可抑制肺癌A549细胞的生长，诱导人肺癌A549细胞凋亡，同时可诱导人肺癌A549细胞自噬。LP1-PI3K样蛋白可初步归类为III型PI3K，其诱导的凋亡、自噬及其相互之间的作用机制有待深入研究。
【关键词】：香菇C91-3菌 Latcripin-1蛋白 自噬 PI3K结构域 LC3
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：
- 摘要8-11
- Abstract11-14
- 前言14-16
- 第一部分 香菇 C91-3 菌 LP1-PI3K 样结构域原核表达载体的构建及序列分析16-26
- 1. 材料16-17
- 1.1 质粒与菌株16
- 1.2 主要仪器及试剂16-17
- 1.3 实验所需引物17
- 2. 方法17-20
- 2.1 LP1-PI3K 基因的获得17-18
- 2.2 引物设计和 PCR 扩增特异性基因片段18
- 2.3 克隆载体 pMD19-T-LP1-PI3K 的构建及筛选18-19
- 2.4 表达载体 pET-32a-LP1-PI3K 的构建及筛选19-20
- 2.5 LP1-PI3K 样蛋白结构分析20
- 3. 结果20-26
- 3.1 LP1-PI3K 基因的获得20-21
- 3.2 克隆载体 pMD19-T-LP1-PI3K 的构建及鉴定21-22
- 3.3 表达载体 pET-32a-LP1-PI3K 的构建及鉴定22-24
- 3.4 LP1-PI3K 样蛋白结构分析24-26
- 第二部分 香菇 C91-3 菌 LP1-PI3K 样蛋白在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中的表达分离和纯化26-32
- 1. 材料26-27
- 1.1 主要仪器26
- 1.2 主要试剂26-27
- 2. 方法27-30
- 2.1 LP1-PI3K 样蛋白在 E.coli Rosetta-gami(DE3) 中的诱导表达27
- 2.2 Western-blot 分析27-28
- 2.3 LP1-PI3K 样蛋白的纯化28-29
- 2.4 LP1-PI3K 样蛋白(包涵体)的尿素梯度复性29-30
- 3. 结果30-32
- 3.1 LP1-PI3K 样蛋白在 E.coli Rosetta-gami(DE3) 中的诱导表达30
- 3.2 Western-blot 分析30-31
- 3.3 LP1-PI3K 样蛋白纯化后 SDS-PAGE 电泳结果及Western-blot 鉴定31-32
- 第三部分 香菇 C91-3 菌 LP1-PI3K 样蛋白抗肿瘤活性及作用机制的初步研究32-42
- 1. 材料32-33
- 1.1 主要仪器32
- 1.2 主要试剂32
- 1.3 细胞株32-33
- 2. 方法33-35
- 2.1 人肺癌 A549 细胞的培养33
- 2.2 MTT 法测定 LP1-PI3K 样蛋白的抑瘤率33
- 2.3 流式细胞仪测定 LP1-PI3K 样蛋白对肿瘤细胞的影响33-34
- 2.4 透射电镜观察细胞亚显微结构34
- 2.5 Western-blot 分析 LC3 表达34-35
- 3. 结果35-42
- 3.1 MTT 法测定 LP1-PI3K 样蛋白的对细胞的抑制率35-36
- 3.2 流式细胞仪测定 LP1-PI3K 样蛋白对肿瘤细胞的影响36-39
- 3.3 透射电镜观察细胞亚显微结构39-41
- 3.4 Western-blot 分析 LC3 表达41-42
- 讨论42-44
- 结论44-45
- 参考文献45-49
- 综述49-63
- 参考文献58-63
- 附录63-64
- 攻读学位期间发表文章情况64-65
- 致谢65-66
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
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本文关键词：香菇C91-3菌LP1-PI3K样蛋白的克隆表达、分离纯化及其活性研究，由笔耕文化传播整理发布。
本文编号：403656
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