微小隐孢子虫部分含TSP1结构域蛋白对上皮细胞的粘附特性研究

发布时间：2017-05-29 23:03

  本文关键词：微小隐孢子虫部分含TSP1结构域蛋白对上皮细胞的粘附特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：隐孢子虫（Cryptosporidium）是世界范围内医疗界和兽医界公认的重要肠道寄生虫，可以导致人类和动物的隐孢子虫病。其中微小隐孢子虫（C.parvum）的感染对人畜健康威胁最大。该病在健康人群中引起自限性腹泻疾病，但免疫缺陷的人群感染该病后病情严重甚至危及生命。目前研制开发相关抗体和疫苗的阻碍主要在于缺少对微小隐孢子虫致病机理的了解。 宿主细胞表面受体和寄生虫表面配体通过相互作用来调节微小隐孢子虫粘附和侵入宿主细胞膜，这是由数个复杂的过程构成，它涉及了多种寄生虫分子和宿主分子。为了掌握隐孢子虫病隐性感染的机制并制定治疗隐孢子虫病的策略，我们必需知晓这些过程的分子机制。在顶复门其它寄生原虫中，含TSP1样结构域的蛋白在虫体粘附侵入宿主细胞中发挥重要的作用，经过对微小隐孢子虫基因组序列的筛选，含TSP1结构域的基因共有12种，这些基因都含有信号肽序列及1个或多个TSP1样结构域，另外还包含其他参与细胞间相互作用的结构域，如Kringle、表皮生长因子、Apple结构域，特别是目前诸多的研究结果都暗示TSP家族中TRAP-C1蛋白与微小隐孢子虫的粘附密切相关。虽然微小隐孢子虫的TSP家族蛋白的功能还不确定，微小隐孢子虫与顶复门其他寄生虫TRAP家族蛋白序列的同源性和结构的相似性暗示微小隐孢子虫TSP家族蛋白可能也参与侵入宿主细胞的过程。 本实验选择CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10四种蛋白进行研究。从基因库中选取目的基因片段进行原核表达，并通过Western blotting、亲和ELISA、Cell blot3种方法检测以上4种重组蛋白对上皮样细胞是否具有粘附作用。 根据GenBank上CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10的基因序列设计引物，经过PCR扩增后得到CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10目的基因片段的大小分别为420bp、587bp、603bp和897bp。将目的片段连接在pMD18-T载体上，对构建的克隆载体鉴定、测序正确后，将目的片段克隆在表达载体上，再将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。对构建的四种表达载体鉴定、测序及比对。经过表达温度条件的比较和不同温度下重组蛋白可溶性的比较后选择最佳表达条件，经0.1mmol/L IPTG诱导菌体大量表达后超声破菌，从而获得可溶性表达产物，对目的蛋白质用Gluthathione-Sepharose4B磁珠进行纯化，经SDS-PAGE和Western blot鉴定rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10，相对分子量分别为41KDa、47KDa、45KDa、58KDa，与预计的分子量大小相符。 以纯化的rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10为抗原，采用抗原与弗氏佐剂混合乳化的方式免疫BALB/c小鼠，从而制备多克隆抗体。将4种蛋白分别与Caco-2细胞、HCT-8细胞、MDBK细胞共孵育后，通过Westernblotting检测到rGST-TSP6和rGST-TSP8能结合上述3种细胞，而GST蛋白不结合。通过细胞亲和ELISA的方法测定4种重组蛋白对3种细胞的结合，发现rGST-TSP6和rGST-TSP8与3种细胞的结合与对照组GST蛋白相比差异显著（P0.05），且在一定浓度范围内呈现剂量依赖性。通过非变性凝胶电泳将4种重组蛋白转移到NC膜上，再与3种悬浮细胞共孵育后，通过氨基黑染色发现rGST-TSP6和rGST-TSP8可以与3种细胞结合，同时，该结合可以被针对蛋白质的多克隆抗体阻断。表明该结合具有特异性。 因此，TSP家族中的CpTSP6和CpTSP8蛋白参与了微小隐孢子虫与宿主细胞的黏附过程。
【关键词】：微小隐孢子虫 TSP1结构域 黏附 Cell blot Western blotting、亲和ELISA
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.3
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-14
• 第一篇 文献综述14-28
• 第一章 微小隐孢子虫粘附相关蛋白研究进展14-28
• 1.1 隐孢子虫简介14-16
• 1.2 微小隐孢子虫主要的粘附相关蛋白16-27
• 1.3 结语27-28
• 第二篇 研究内容28-78
• 第一章 微小隐孢子虫 TSP6、TSP7、TSP8、 TSP10 基因的克隆及表达28-56
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-42
• 1.3 结果42-52
• 1.4 讨论52-55
• 1.5 小结55-56
• 第二章 HCT-8、Caco-2、MDBK 三种上皮细胞的培养56-60
• 2.1 材料56-57
• 2.2 方法57-58
• 2.3 结果58
• 2.4 讨论58-59
• 2.5 小结59-60
• 第三章 rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10 对三种上皮细胞系粘附特性的研究60-78
• 3.1 材料60-62
• 3.2 方法62-66
• 3.3 结果66-74
• 3.4 讨论74-76
• 3.5 小结76-78
• 结论78-79
• 参考文献79-89
• 导师简介89-90
• 作者简介90
• 攻读硕士学位期间取得的成果90-91
• 致谢91

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈锡慰;微小隐孢子虫抗体在体外和体内对其感染力的抑制作用[J];国外医学.寄生虫病分册;1995年02期

2 徐志敏;墨西哥腹泻儿童的微小隐孢子虫感染[J];国外医学.寄生虫病分册;1995年03期

3 周荣琼;李国清;黄汉成;肖淑敏;;PCR-RFLP技术及其在隐孢子虫基因分析上的应用[J];中国人兽共患病杂志;2005年12期

4 蔡黎;健康志愿者中微小隐孢子虫的感染[J];国外医学.寄生虫病分册;1996年02期

5 郭步平,张建斌,连德润;微小隐孢子虫DNA探针的制备[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1999年02期

6 李小红,曹建平,刘述先;微小隐孢子虫抗原的研究进展[J];国外医学.寄生虫病分册;2005年02期

7 郭步平,连德润;隐孢子虫动物模型的建立[J];中国寄生虫病防治杂志;1997年02期

8 宗海红,李为明,张雪,俞树荣,白班俊;抗微小隐孢子虫单克隆抗体免疫保护作用的研究[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1999年02期

9 徐卫东,张西臣,孔庆昌,刘明远,尹继刚,李建华,杨举,何宏轩,吕亚坚;微小隐孢子虫cDNA文库的构建及P23、CP15/60基因的克隆[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2002年05期

10 蒋就喜,肖福英,何莉珠,刘陶文,黄键;聚合酶链反应检测隐孢子虫[J];中华传染病杂志;2001年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 秦培兰;米荣升;黄燕;周鹏;张国恩;苏庆美;呼高伟;曹薇;陈兆国;;微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及其抗血清的制备[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

2 刁玉梅;宫鹏涛;李建华;苏利波;杨举;李赫;张国才;张西臣;;微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年

3 李建华;张西臣;尹继刚;杨举;田宗成;;微小隐孢子虫病毒S-dsRNA基因在大肠 杆菌中的高效表达[A];中国动物学会第七届全国青年寄生虫学工作者学术讨论会论文摘要集[C];2002年

4 尹继刚;张西臣;李建华;何宏轩;杨举;田宗成;万敏;王延钊;;抗微小隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体的制备及初步鉴定[A];中国动物学会第七届全国青年寄生虫学工作者学术讨论会论文摘要集[C];2002年

5 耿艺介;高世同;黄达娜;黄薇;张锦周;孙微;张仁利;;食品水源中微小隐孢子虫18S rRNA鉴定方法的研究[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年

6 李建华;张西臣;尹继刚;杨举;;微小隐孢子虫病毒L-dsRNA基因原核表达载体的构建及表达[A];中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年

7 薛霞;张西臣;李建华;尹继刚;杨举;阎广谋;;微小隐孢子虫Cpgp40/15基因的真核表达及其免疫保护性研究[A];中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年

8 罗晓冰;卢思奇;陈小宁;王凤云;;实验感染昆明鼠粪便微小隐孢子虫18SrRNA基因检测[A];中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年

9 卢思奇;王凤云;张可;徐莲芝;;AIDS合并感染的微小隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫基因检测研究[A];全国新出现传染病学术研讨会资料汇编[C];2004年

10 陆惠民;;微小隐孢子虫病[A];全国EID研讨班资料汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 常正山;鼠类是传播多种人兽共患寄生虫病的罪魁祸首[N];大众科技报;2008年

2 黄才刚;隐孢子虫检测技术革新[N];健康报;2002年

3 郑剑宁/编译;压舱水——一个潜在的公共卫生问题[N];中国国门时报(中国出入境检验疫报);2002年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 肖丹;微小隐孢子虫粘附相关蛋白基因的筛选及免疫保护性研究[D];吉林大学;2010年

2 李世杰;微小隐孢子虫cp966基因重组乳酸杆菌口服活载体疫苗研究[D];吉林大学;2013年

3 姚龙泉;微小隐孢子虫粘附相关蛋白基因的筛选、表达及免疫保护性研究[D];吉林大学;2006年

4 陈兆国;上海地区动物隐孢子虫病分子流行病学调查及微小隐孢子虫miRNA的初步鉴定[D];中国农业科学院;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 黄清花;微小隐孢子虫感染小鼠肠道细胞因子和抗菌肽表达[D];吉林大学;2013年

2 殷驰;微小隐孢子虫粘附相关蛋白基因的筛选及免疫特性研究[D];吉林大学;2010年

3 牛姝婉;微小隐孢子虫转运蛋白免疫原性及微小隐孢子虫和鸵鸟源小鼠隐孢子虫寄生部位初步研究[D];河南农业大学;2011年

4 秦培兰;微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60三价亚单位疫苗和核酸疫苗的制备及其免疫保护性研究[D];中国农业科学院;2012年

5 刁玉梅;微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用[D];吉林大学;2011年

6 高华义;基于微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白Dot-ELISA检测方法的建立[D];吉林大学;2013年

7 范大为;乳酸菌和大肠杆菌对微小隐孢子虫感染BALB/c鼠的影响[D];吉林大学;2012年

8 兰丽;微小隐孢子虫Cp23基因在短乳杆菌S-层蛋白中的嵌合型原核表达载体的构建[D];内蒙古农业大学;2012年

9 薛霞;微小隐孢子虫Cpgp40/15基因的真核表达及其免疫保护性研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年

10 石泉;在干酪乳杆菌中微小隐孢子虫p23基因的表达及其应用[D];内蒙古农业大学;2010年

  本文关键词：微小隐孢子虫部分含TSP1结构域蛋白对上皮细胞的粘附特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：405847