小鼠支持细胞重编程为诱导多能干细胞的研究

发布时间：2017-05-30 14:06

  本文关键词：小鼠支持细胞重编程为诱导多能干细胞的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：体细胞异位表达特异性转录因子可以重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞)。iPS细胞不仅具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)相同的多能性和自我更新能力,还可以避免临床治疗过程中的免疫排斥和各种伦理道德问题。因此,iPS细胞技术不仅为科研基础理论研究提供了新的技术手段,也为再生医学领域带来了广阔的应用前嘛号。目前,尽管已经获得多种体细胞来源的iPS细胞,但不同来源的iPS细胞质量参差不齐,在基因表达图图谱,表观遗传修饰及分化能力等方面存在差异。因此,根据实验目的选择合适的体细胞是获得高质量、具有发育全能性的优质iPS细胞的前提。 小鼠支持细胞(Sertoli cells)是睾丸的重要组成成分,具有免疫豁免和为生精过程提供适宜微环境的作用。离体培养时,支持细胞增殖速度较快,生长状态良好,自身表达Klf4和c-Myc等基因。支持细胞分离纯化后可得到高纯度同质性细胞群,排除了异质性细胞群对重编程实验的干扰。因此,支持细胞重编程为iPS细胞为后续诱导生精细胞提供源细胞。 一氧化氮(nitric oxide, NO)是细胞内信号分子,参与干细胞生长增殖调控。NO对干细胞调控呈浓度依赖性,高浓度NO促进干细胞分化,低浓度NO维持干细胞多能性。探索NO对iPS细胞的影响对iPS细胞长期体外增殖分化有重要作用。 本实验主要目的是将小鼠支持细胞重编程为iPS细胞并探索NO对iPS细胞的影响。分为以下方面：逆转录病毒载体的扩增与检测；支持细胞的分离培养及纯化；逆转录病毒液获得及感染支持细胞；iPS克隆获得及鉴定；低浓度NO对iPS细胞的影响。主要研究结果如下： 1.酶切和测序鉴定证实了扩增的逆转录病毒载体的准确性。 2.获得高纯度小鼠支持细胞：通过两步酶消化法从小鼠睾丸中分离支持细胞,并且通过密度梯度离心法及差速贴壁法纯化小鼠支持细胞。原代培养的小鼠支持细胞具有良好的生长状态,SGP-1、SGP-2、Transferrin、ABP及AMHII等支持细胞特异性标记物表达,Klf4和c-Myc表达水平较低,Nanog、Sox2及Oct4等多能基因不表达。 3.成功构建小鼠支持细胞iPS细胞系：将四种重编程因子导入支持细胞,同时以GFP空载体检测病毒感染情况。感染的支持细胞在3d左右表达GFP。同时细胞开始缩小聚集,失去原有支持细胞形态,逐步形成突起样克隆,18d左右感染的支持细胞不表达GFP荧光,形成具有典型干细胞特性的iPS细胞。iPS细胞可以体外长期增殖并保持正常核型。 4.iPS细胞系鉴定：iPS细胞AKP染色呈阳性,可表达多种ES细胞特异性基因,发Nanog、Oct4、Sox2、Rex1、Fbxl5、E-cad和Fgf4等,并且表达水平与ES细胞相近；Nanog和Oct4免疫染色呈阳性。在细胞周期调控模式上,iPS细胞与ES细胞相近。重编程的iPS细胞内源多能基因激活,外源转录基因沉默。同时,iPS细胞具有分化为多种细胞的能力。体外培养时,可形成拟胚体,获得的拟胚体可分化为三个胚层细胞,同时自发分化为跳动的克隆团；体内培养时形成畸胎瘤,畸胎瘤经HE染色后可以观察到不同胚层的组织衍生物。 5.低浓度NO促进Nanog表达,维持多能基因Oct4和Sox2、抗凋亡基因Bcl2和Bc12lll及促凋亡基因Bac表达水平,下调促凋亡基因Bak1及Casp7基因表达水平。表明低浓度NO可以维持iPS细胞的多能性,并可以延缓在无LIF条件下iPS细胞的凋亡作用,维持其自我更新。
【关键词】：支持细胞 重编程 转录因子 iPS细胞 一氧化氮
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 缩略语中英文对照12-14
• 第一部分 文献综述14-24
• 第一章 体细胞重编程技术14-19
• 1. 体细胞核移植介导的细胞重编程14-15
• 2. 体细胞融合或共培养介导的体细胞重编程15
• 3. iPS细胞重编程技术15-17
• 4. 谱系重编程技术17-19
• 4.1 体内重编程17-18
• 4.2 体外重编程18
• 4.3 谱系重编程特征18-19
• 参考文献19-24
• 第二部分 试验研究24-82
• 第一章 逆转录病毒载体的扩增与检测24-34
• 1 材料与方法24-28
• 1.1 试验材料24-25
• 1.2 试验方法25-28
• 2 试验结果与分析28-30
• 2.1 获得单克隆最佳的接种体积28
• 2.2 逆转录病毒载体浓度和纯度鉴定28-29
• 2.3 逆转录病毒载体测序鉴定29-30
• 3 讨论30-31
• 参考文献31-34
• 第二章 小鼠支持细胞的原代培养34-44
• 1 材料与方法34-39
• 1.1 试验材料34-35
• 1.2 试验方法35-39
• 2 试验结果与分析39-40
• 2.1 支持细胞生物学特征39
• 2.2 支持细胞总RNA的完整性39
• 2.3 支持细胞PCR鉴定39-40
• 3 讨论40-41
• 参考文献41-44
• 第三章 小鼠支持细胞重编程为iPS细胞44-58
• 1 材料与方法44-49
• 1.1 试验材料44-45
• 1.2 试验方法45-49
• 2 试验结果与分析49-55
• 2.1 原代培养MEF生物学特性49
• 2.2 逆转录病毒液的获取49-50
• 2.3 逆转录病毒液滴度测定50-51
• 2.4 病毒液感染支持细胞后支持细胞重编程变化过程51-53
• 2.5 重编程过程中荧光蛋白表达与沉默53-54
• 2.6 iPS细胞获得54-55
• 3. 讨论55-56
• 参考文献56-58
• 第四章 支持细胞来源的iPS细胞鉴定58-74
• 1 材料与方法58-64
• 1.1 试验材料58-59
• 1.2 试验方法59-64
• 2 试验结果与分析64-69
• 2.1 iPS细胞AKP活性分析64-65
• 2.2 iPS细胞核型分析65
• 2.3 iPS细胞的周期分布模式65-67
• 2.4 iPS细胞多能基因表达模式67-68
• 2.5 iPS细胞体外分化68
• 2.6 iPS细胞体内分化68-69
• 3. 讨论69-71
• 参考文献71-74
• 第五章 低浓度NO维持iPS细胞自我更新及多能性74-82
• 1 材料与方法74-76
• 1.1 试验材料74-75
• 1.2 试验方法75-76
• 2 试验结果与分析76-79
• 2.1 多能基因Nanog表达水平分析76-78
• 2.2 多能基因Oct4表达水平分析78
• 2.3 多能基因Sox2表达水平分析78
• 2.4 抗凋亡基因Bcl2lll表达水平分析78
• 2.5 抗凋亡基因Bcl2表达水平分析78-79
• 2.6 促凋亡基因Bac表达水平分析79
• 2.7 促凋亡基因Bak1表达水平分析79
• 2.8 促凋亡基因Casp7表达水平分析79
• 3. 讨论79-80
• 参考文献80-82
• 全文结论82-84
• 创新点84-86
• 攻读硕士期间发表的论文86-88
• 致谢88-89

【共引文献】

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  本文关键词：小鼠支持细胞重编程为诱导多能干细胞的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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